武漢工業(yè)學(xué)院 劉立鶴

○武漢工業(yè)學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品蛋白質(zhì)飼料

資源教育部工程研究中心 賀國(guó)龍

安琪酵母股份有限公司 李兆文

酵母源生物飼料是以酵母為載體，依托現(xiàn)代生物技術(shù)，運(yùn)用微生物發(fā)酵和酶解工藝，而獲得的具有特定功能和營(yíng)養(yǎng)性的飼料和飼料添加劑產(chǎn)品。本試驗(yàn)分別采用了凱氏定氮法、Folin-酚法和考馬斯亮藍(lán)法對(duì)飼用高活性干酵母、酵母細(xì)胞壁多糖和復(fù)合酵母進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料與設(shè)備。試驗(yàn)酵母源生物飼料樣品分別為福邦?飼用高活性干酵母（水產(chǎn)）、福邦?酵母細(xì)胞壁多糖（水產(chǎn)）和福邦?復(fù)合酵母（水產(chǎn)），為安琪酵母股份有限公司提供。

（1）蛋白質(zhì)測(cè)定所需試劑。凱氏定氮法：硫酸，硫酸銅，無(wú)水硫酸鉀，40%氫氧化鈉，2%硼酸，混合指示劑：甲基紅0.1%乙醇溶液，溴鉀酚綠0.5%乙醇溶液，兩溶液等體積混合，陰涼期保存期3個(gè)月以內(nèi)，0.05mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，催化劑為3份硫酸銅與50份無(wú)水硫酸鉀混合。

Folin-酚法：試劑甲：（A）10gNa2CO3，2gNaOH 和 0.25g酒 石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500mL蒸餾水中。（B）0.5g硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解于100mL蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。試劑乙(商用成品）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:精確稱取0.1018g結(jié)晶牛血清清蛋白(BSA)，溶于1L0.9%NaCl溶液中，制成濃度為c=101.8μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

考馬斯亮藍(lán)法：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（同F(xiàn)olin-酚法所用配制）?？捡R斯亮藍(lán)G-250染料試劑（南京建成科技有限公司）

（2）試驗(yàn)所需儀器。分析天平0.0001g感量，消煮爐，酸式滴定管（50mL），凱氏燒瓶（500mL），半微量水蒸氣蒸餾式，錐形瓶，容量瓶（100mL），通風(fēng)櫥；721型可見(jiàn)光分光光度計(jì)；電子計(jì)時(shí)器；試管、燒杯若干，Agilent1100液相色譜。

2.試驗(yàn)樣品前處理。以烘干至恒重的酵母源生物飼料為試驗(yàn)樣品，以消除水分對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

3.蛋白含量的分析方法。

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制。準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)蛋白m=0.1018g溶于1000mL的蒸餾水中，配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，濃度為101.8μg/mL。

（2）凱氏定氮法測(cè)蛋白質(zhì)含量。采用GB5511-1985法檢測(cè)酵母源生物飼料中蛋白質(zhì)含量，并參考王潔等蛋白質(zhì)測(cè)定的相關(guān)注意事項(xiàng)，以減少蛋白質(zhì)損失。

（3）Folin-酚法測(cè)蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取10支大試管，1支作空白，其余試管分成兩組，分別加入0、0.05、0.10、0.15、0.20、 0.30、0.40、0.50、0.70、0.90mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為101.8μg/mL）。用水補(bǔ)足到1.0mL，然后每支試管加入5mL試劑甲，然后迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10min。逐管加入0.5mL試劑乙（Folin-酚試劑），立即混勻后，置于室溫30min，以未加蛋白質(zhì)溶液的作為空白對(duì)照，于700nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。

（4）考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取7支試管，1支作空白，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用101.8μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，然后用無(wú)離子水補(bǔ)充到1.0mL。最后各試管中分別加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，加完后立即混合，勿過(guò)于劇烈。

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品A595值，求出未知樣品蛋白質(zhì)含量。

（5）氨基酸的檢測(cè)方法。試驗(yàn)樣品的氨基酸分析采用6N鹽酸水解后，按照國(guó)標(biāo)GB/T18246-2000，用外標(biāo)法，在Aglient1100上分析，送武漢工業(yè)學(xué)院分析測(cè)試中心進(jìn)行測(cè)定。

4.不同蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的初步評(píng)價(jià)。以3種酵母源生物飼料氨基酸檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，與3種不同蛋白質(zhì)檢測(cè)方法實(shí)際測(cè)得的蛋白質(zhì)值進(jìn)行比較，初步設(shè)定與樣品氨基酸結(jié)果接近程度作為評(píng)價(jià)指數(shù)，評(píng)價(jià)指數(shù)=100%×被測(cè)原料蛋白質(zhì)含量/被測(cè)原料氨基酸含量－100%。

5.統(tǒng)計(jì)分析及方法。測(cè)定數(shù)據(jù)用Excel軟件中進(jìn)行初步處理和作圖，再用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(X±SD)表示。

二、結(jié)果與分析

1.Folin-酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。見(jiàn)圖1。

圖1 Folin-酚法標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程

2.考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。見(jiàn)圖2。

圖2 考馬斯亮藍(lán)法標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程

3.樣品檢測(cè)結(jié)果與分析。將干燥好的酵母源生物飼料測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。其中，一份用豆?jié){機(jī)物理破碎，加入生理鹽水混勻，然后用離心機(jī)離心，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，采用不同的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，見(jiàn)表1。

表1 破碎機(jī)處理后樣品的蛋白質(zhì)檢測(cè)值（%） （n=4）

另取一份加入生理鹽水，用細(xì)胞超聲波細(xì)胞破碎儀處理后用離心機(jī)離心，取上清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后分別用Folin-酚法和考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，見(jiàn)表2。

表2 超聲波細(xì)胞破碎儀處理后的樣品的蛋白質(zhì)檢測(cè)值（%） （n=4）

三、討論

1.凱氏定氮法對(duì)測(cè)定酵母原料蛋白質(zhì)含量的影響。由表1可知，凱氏定氮法對(duì)飼用高活性干酵母、酵母細(xì)胞壁多糖和復(fù)合酵母中蛋白質(zhì)含量測(cè)定時(shí)結(jié)果都與高效液相色譜儀所測(cè)氨基酸相差很大，分別偏高50.08%、122.16%和55.64%。這主要是因?yàn)閯P氏定氮法檢測(cè)的指標(biāo)是蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、尿素和氮為負(fù)三價(jià)的有機(jī)氮化合物，使結(jié)果偏高。因此，采用測(cè)定總含氮量的方法間接測(cè)定酵母源生物飼料中蛋白質(zhì)含量，檢測(cè)的蛋白質(zhì)含量高于實(shí)際蛋白質(zhì)的含量。

2.Folin-酚法對(duì)測(cè)定酵母原料蛋白質(zhì)含量的影響。Folin-酚法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。

在Folin-酚法中，由于加入了Folin-酚試劑強(qiáng)化了雙縮脲反應(yīng)，使得顯色量增強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度提高且比較恒定，因而被廣泛應(yīng)用于不同環(huán)境中的蛋白質(zhì)混合物或粗提物的測(cè)定。然而，其操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，且易受到多種因素影響的缺點(diǎn)。

3.考馬斯亮藍(lán)法對(duì)測(cè)定酵母原料蛋白質(zhì)含量的影響。由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此，Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，本試驗(yàn)中飼用高活性干酵母、酵母細(xì)胞壁多糖和復(fù)合酵母中的精氨酸和苯丙氨酸之和占總氨基酸比例分別為13.45%、18.53%和15.01%，對(duì)結(jié)果影響較大，但影響多大還不得而知。

四、小結(jié)

試驗(yàn)表明，F(xiàn)olin-酚法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度為0-91.62μg/mL范圍內(nèi)時(shí)與吸光度值有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9956?？捡R斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度為0-101.80μg/mL范圍內(nèi)時(shí)與吸光度值有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9916。二者都能較為準(zhǔn)確地測(cè)定酵母細(xì)胞壁多糖的蛋白含量。