白雪飛，陳可泉，葉貴子，黃秀梅，李建，姜岷

南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料化學工程國家重點實驗室，南京 210009

發(fā)酵產(chǎn)丁二酸過程中廢棄細胞的循環(huán)利用

白雪飛，陳可泉，葉貴子，黃秀梅，李建，姜岷

南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料化學工程國家重點實驗室，南京 210009

對厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸后的廢棄細胞進行破壁處理，考察了以細胞水解液作為有機氮源重新用于丁二酸發(fā)酵的可行性。比較了超聲破碎、鹽溶、酶解 3種方法破碎細胞獲得的水解液作為氮源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的效果，結(jié)果表明酶解制得的細胞水解液效果最佳。以總氮含量為1.11 g/L的酶解液(相當于10 g/L酵母膏)作為氮源發(fā)酵，丁二酸產(chǎn)量可達42.0 g/L，繼續(xù)增大酶解液用量對耗糖、產(chǎn)酸能力沒有顯著提高。將細胞酶解液與5 g/L酵母膏聯(lián)用發(fā)酵36 h后，丁二酸產(chǎn)量達75.5 g/L，且丁二酸生產(chǎn)強度為2.10 g/(L·h)，比使用10 g/L酵母膏時提高了66.7%。因此，厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸結(jié)束后的廢棄細胞酶解液可以替代原培養(yǎng)基中50%的酵母膏用于發(fā)酵。

廢棄細胞，酶水解，氮源，丁二酸

Abstract:Spent cells recovered from anaerobic fermentation byActinobacillus succinogeneswere used as nitrogen source for succinic acid production.Three methods were investigated for cell wall-breaking.The results showed that enzymatic hydrolysis was more effective for higher succinic acid yield.When the enzymatic hydrolysate of spent cells was added to reach a total nitrogen concentration 1.11 g/L(equivalent to 10 g/L yeast extract), the succinic acid concentration was 42.0 g/L, but it increased slightly when enhancing the level of enzymatic hydrolysate.However, when 5 g/L yeast extract was supplemented with the enzymatic hydrolysate of spent cells, the succinic acid concentration reached 75.5 g/L after 36 hours and, the succinic acid productivity was 2.10 g/(L·h), which increased by 66.7% compared with the fermentation using 10 g/L yeast extract.Therefore, enzymatic hydrolysate of spent cells could replace 50% yeast extract in the original medium for succinic acid production.

Keywords:recycle spent cells, enzymatic hydrolysis, nitrogen source, succinic acid

微生物細胞作為一個有機體，其胞內(nèi)含有豐富的氨基酸、維生素及其他微量元素[1-2]。發(fā)酵生產(chǎn)中，微生物細胞在發(fā)酵結(jié)束后常常被作為廢棄物而丟棄，造成環(huán)境污染以及資源浪費。因此，將廢棄細胞作為營養(yǎng)源重新利用具有重要的意義。York等[3]以廢酵母細胞自溶液為氮源，補加營養(yǎng)鹽和維生素后用于乙醇的生產(chǎn)，其乙醇產(chǎn)量與以蛋白胨為氮源時相當，達到46 g/L；Marco等[4]研究了酵母細胞自溶液在乙醇生產(chǎn)中的應用，證明了酵母細胞自溶液能夠為乙醇的生產(chǎn)提供必要的氨基酸、脂肪酸等物質(zhì)，使乙醇產(chǎn)量達到12%(V/V)。Gao等[5-6]以鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus細胞水解液作為氮源用于乳酸的發(fā)酵時可以使原培養(yǎng)基中酵母膏用量減少20%，乳酸產(chǎn)量達到80 g/L；Amrane[7]在考察乳酸桿菌自溶液用于乳酸發(fā)酵的效果時，乳酸產(chǎn)量最高達到38 g/L，與2 g/L酵母膏的發(fā)酵產(chǎn)乳酸能力相當。

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸與化學法相比，具有利用可再生資源、固定 CO2等優(yōu)點，近年來備受矚目。在眾多的丁二酸生產(chǎn)菌株中，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes具有高產(chǎn)丁二酸、耐高底物、產(chǎn)物濃度、可以利用廣泛碳源等優(yōu)點，已成為目前具備產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)丁二酸能力的菌株之一[8]。然而，A.succinogenes培養(yǎng)過程中通常需要添加酵母膏等營養(yǎng)源用于菌體生長與產(chǎn)酸[9]，這些營養(yǎng)成分價格昂貴，無法適應丁二酸工業(yè)化生產(chǎn)的需求。本文將丁二酸發(fā)酵后的廢棄細胞制得的水解液替代培養(yǎng)基中部分氮源重新用于丁二酸發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 菌種

Actinobacillus succinogenesNJ113(CGMCC No.1716)為本實驗室篩選并保藏。1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10.0，酵母膏 5.0，NaHCO310.0，NaH2PO49.6，K2HPO415.5，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：富馬酸二鈉 1.0，KH2PO43.0，MgCl2·6H2O 0.3，CaCl20.3，NaCl 1.0，酵母膏10.0 g/L或含有相應總氮質(zhì)量的廢棄細胞水解液，一定濃度葡萄糖分消后加入，加入與葡萄糖等質(zhì)量的MgCO3調(diào)節(jié)發(fā)酵pH。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清瓶培養(yǎng)

將A.succinogenes接種到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的血清瓶(血清瓶容積100 mL)中進行活化培養(yǎng)10 h后，按5%接種量將種子液接于裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的血清瓶(血清瓶容積100 mL)中，37℃下200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

1.3.2 3L發(fā)酵罐培養(yǎng)

3 L發(fā)酵罐(BIOFLO 110，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA)裝有1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基。接種量5%，培養(yǎng)溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，CO2流速0.3 L/min，發(fā)酵至葡萄糖不再消耗。

1.3.3 細胞的破碎方法

將丁二酸發(fā)酵結(jié)束后的細胞離心收集，用蒸餾水洗滌2次之后配制成60 g/L的菌懸液。采用超聲波、自溶和酶水解 3種方法對菌懸液進行處理。超聲破碎法[4]：將菌懸液在150 W的功率下超聲處理20 min；自溶法[3]：向菌懸液中加入1%(W/V)NaCl和6%(W/V)無水乙醇，50℃水浴處理24 h；酶水解法：將菌懸液在pH 8.0，55℃下采用堿性蛋白酶(活力2.4 AU/g)水解24 h，其中酶添加量為3.45 μL/g干細胞。3種方法分別處理后得到的水解液在8 000 r/min下離心15 min，得到上清液即為所需的細胞水解液，測定其中氨基氮Amino nitrogen(AN)、總氮Total nitrogen(TN)含量后用于配制培養(yǎng)基。當培養(yǎng)基中需添加總氮含量大于2.22 g/L的酶解液時，先將酶解液濃縮1倍后再用于配制培養(yǎng)基。

1.3.4 分析方法

葡萄糖濃度由生物傳感分析儀(山東省科學院生物研究所)測定，菌體生長以紫外可見分光光度計(上海棱光技術有限公司)測定波長660 nm處吸光值(OD660)表示，AN、TN含量分別用甲醛滴定法[10]和凱氏定氮法測定[11]，丁二酸含量采用 HPLC(美國戴安公司)法測定[12]，丁二酸收率(%)=[丁二酸產(chǎn)量(g/L)/葡萄糖消耗量(g/L)]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞水解液的制備及用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸

分別采用超聲波、自溶和酶水解 3種不同的方法對丁二酸發(fā)酵結(jié)束后的細胞進行破碎，通過測定水解液中氨基氮及總氮含量，考察 3種方法的破壁效果，結(jié)果見表1。

表1 3種細胞破碎法對水解液中AN含量及水解度的影響Table 1 Effects of three kinds of cell disruption on the AN content and AN/TN ratio in the hydrolysate

由表 1可知，酶水解液 Enzymatic hydrolysate(EH)中AN含量和水解度(AN/TN)最高，其次是超聲破碎法制得的水解液 Ultrasonic hydrolysate(UH)，自溶法制得水解液Autolysate(AS)中AN的含量僅為酶水解液的一半左右。

在葡萄糖濃度 20 g/L及相同總氮添加量條件下，考察 3種水解液分別作為氮源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的效果。由圖1可知，當EH作為氮源時，丁二酸產(chǎn)量與菌體生長量較高，而UH和AS作為氮源時發(fā)酵效果較差，且菌體幾乎不能利用 AS作為氮源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸。雖然 EH與 UH在氨基氮含量、水解度方面相差不大，但其發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的能力卻相差甚遠，利用EH作為氮源時丁二酸產(chǎn)量是采用UH的8倍。文獻報道，在利用超聲波破碎細胞時，超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活[13]，從而有可能影響了 UH用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的效果；自溶雖然是一種比較經(jīng)濟的細胞破壁方法，但存在水解收率低、水解液中殘余鹽濃度高等缺點[1]，且高濃度的Na+以及乙醇對A.succinogenes的生長代謝均有抑制作用[14]。因此，本研究選擇酶解法制備細胞水解液作為氮源用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸。

圖1 利用不同水解液制備丁二酸的結(jié)果對比Fig.1 Succinic acid production from different hydrolysates.UH: ultrasonic hydrolysate; AS: autolysate; EH: enzymatic hydrolysate.

2.2 酶解液作為有機氮源用于發(fā)酵制備丁二酸

在葡萄糖濃度100 g/L，不同總氮添加量的條件下考察酵母膏(YE)和酶解液分別作為氮源對于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酵母膏和酶解液分別作為氮源發(fā)酵制備丁二酸Fig.2 Succinic acid production with yeast extract and EH separately as nitrogen source.(A)Fermentation with yeast extract.(B)Fermentation with EH.

以4 g/L、5 g/L、6 g/L、10 g/L與16 g/L的酵母膏作為氮源時，其總氮含量分別如圖2A橫坐標所示。隨總氮含量的增加，丁二酸產(chǎn)量增勢較為明顯，當酵母膏的添加量從TN含量0.55 g/L增加到1.11 g/L時，葡萄糖消耗從48 g/L增加到85 g/L，丁二酸產(chǎn)量增加了0.95倍。而以酶解液作為氮源時，圖2B所示，隨著TN含量從0.55 g/L增加至1.11 g/L，葡萄糖的消耗量增加了約 30 g/L，丁二酸產(chǎn)量提高了 3倍，而繼續(xù)增加酶解液用量對丁二酸產(chǎn)量幾乎沒有影響。在TN含量均為1.11 g/L時，菌體生長量相當，然而酶解液用于發(fā)酵的丁二酸產(chǎn)量達36.5 g/L，僅為以酵母膏為氮源時丁二酸產(chǎn)量的一半左右，說明酶解液無法完全替代酵母膏用于丁二酸的制備。文獻報道，在乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，當采用一些廉價的氮源替代時通常也難以完全達到酵母膏的發(fā)酵特性，只能部分取代酵母膏，因此需要添加一定量酵母膏作為氮源用于菌體生長與產(chǎn)乳酸[15]。在前期研究中采用啤酒酵母水解液替代酵母膏時，雖然啤酒酵母水解液在添加混合維生素的基礎上能替代酵母膏用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸，但生產(chǎn)強度仍然較低。因此，本文考慮在酶解液中添加其他氮源用于丁二酸的發(fā)酵生產(chǎn)。

2.3 復合氮源對發(fā)酵制備丁二酸的影響

在葡萄糖濃度為100 g/L的條件下，向TN含量為1.11 g/L(與10 g/L酵母膏TN含量相等)酶解液中分別添加不同量的酵母膏、玉米漿(CSL)，考察對發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響。由表2可知，向酶解液中添加15 g/L CSL后，丁二酸產(chǎn)量只增加了17.2%。而在酶解液中添加3 g/L YE后，丁二酸產(chǎn)量增加了66.9%；添加5 g/L YE以后，丁二酸產(chǎn)量增加了1倍左右，且丁二酸收率達到最大為80.7%，與10 g/L YE發(fā)酵時丁二酸產(chǎn)量相當(圖2)。

2.4 利用復合氮源在3 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵制備丁二酸

在3 L發(fā)酵罐中，分別考察不同氮源對丁二酸發(fā)酵的影響，結(jié)果圖3所示。單獨以酶解液作為氮源發(fā)酵時，葡萄糖消耗速率及產(chǎn)酸速率較慢，OD值僅為8.0，發(fā)酵結(jié)束時殘?zhí)菫?7 g/L，丁二酸產(chǎn)量達42.0 g/L。當在酶解液中添加 5 g/L酵母膏后，OD值高達14，發(fā)酵36 h葡萄糖耗盡，丁二酸產(chǎn)量達到75.5 g/L，發(fā)酵效果與以10 g/L酵母膏作為氮源時的結(jié)果相當，且丁二酸的生產(chǎn)強度達到2.10 g/(L·h)，比單獨采用酵母膏、酶解液發(fā)酵的生產(chǎn)強度分別提高了66.7%和140%。因此，細胞酶解液在補加5 g/L YE后可以完全替代10 g/L酵母膏用于發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，可使原培養(yǎng)基中酵母膏的用量減少50%。在原培養(yǎng)基中氮源所占原料成本的比例約 47.5%，而采用酶解液添加 5 g/L酵母膏作為氮源時其所占原料成本的比例降低為31.8%。

表2 不同氮源組成對發(fā)酵制備丁二酸的影響Table 2 Effects of supplementation of nitrogen sources with EH on succinic acid production

圖3 不同氮源發(fā)酵制備丁二酸Fig.3 Succinic acid production with different nitrogen source.(A)Fermentation with 10 g/L YE.(B)Fermentation with EH.(C)Fermentation with EH supplemented with 5 g/L YE.

3 結(jié)論

分別采用超聲破碎、鹽溶和酶水解 3種方法制備細胞水解液，其中酶解制備的水解液用于發(fā)酵制備丁二酸的效果最佳。

在葡萄糖濃度為100 g/L的條件下，添加TN含量為1.11 g/L的酶解液時，丁二酸產(chǎn)量可達36.5 g/L，然而繼續(xù)增加酶解液用量對丁二酸產(chǎn)量增加不顯著；在TN含量1.11 g/L酶解液中添加5 g/L酵母膏后，丁二酸產(chǎn)量提高102.8%，丁二酸收率高達80.7%。

復合氮源的3 L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)丁二酸實驗結(jié)果表明，酶解液可以替代原培養(yǎng)基中50%的酵母膏用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸，且丁二酸生產(chǎn)強度比采用原培養(yǎng)基時提高了 66.7%，使氮源成本在原料成本中所占的比例由原來的47.5%降低至31.8%。

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Recycle of spent cells from anaerobic succinate fermentation

Xuefei Bai, Kequan Chen, Guizi Ye, Xiumei Huang, Jian Li, and Min Jiang
State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China

Received:March 1, 2010;Accepted:June 22, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2009CB724701), National Natural Science Foundation of China(No.20606017), State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, “Qinglan Project” of Jiangsu Province.

Corresponding author:Min Jiang.Tel: +86-25-83172078; Fax: +86-25-83172075; E-mail: jiangmin@njut.edu.cn國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2009CB724701)，國家自然科學基金(No.20606017)，材料化學工程國家重點實驗室基金，江蘇省“青藍工程”資助。