王博，李莉云，曹英豪，劉子光，劉國振

河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，保定 071001

五個水稻類受體激酶的抗體制備及檢測

王博，李莉云，曹英豪，劉子光，劉國振

河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，保定 071001

類受體激酶在植物發(fā)育、自交不親和、雄性不育、抗逆和抗病等生命過程中起著重要的調控作用。為了對水稻類受體激酶的功能及生物學特性進行深入研究，本實驗克隆表達了水稻中 5個類受體激酶抗原表位片段，以純化的蛋白質為抗原免疫新西蘭兔，獲得了特異性較高的多克隆抗體。Western blotting檢測結果表明，5個類受體激酶均在葉片中表達。

水稻，類受體激酶，蛋白質純化，多克隆抗體

Abstract:Receptor-like kinase involves self-incompatibility, male sterility, stress responses, and disease resistance.To better understand the physiological function and biological characteristics of rice receptor-like kinase, we cloned five predicted epitope fragments of rice receptor-like kinase.The purified fusion protein was used as antigen to immunize rabbit to get specific polyclonal antibodies.Western blotting analysis shows that the five receptor-like kinases were expressed in rice leaves.

Keywords:rice, receptor-like kinase, protein purification, polyclonal antibody

水稻Oryza sativaL.是世界上最重要的谷類作物之一，是研究作物產(chǎn)量、轉基因、雜種優(yōu)勢、植物病蟲害抗性和其他抗逆等方面的重要遺傳材料。近年來，隨著水稻基因組的測序完成，越來越多的研究者將目光投向了這一模式植物。

植物類受體激酶(Receptor-like kinase，RLK)在真核生物中廣泛存在，水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約1 130個類受體激酶，其數(shù)目大約是擬南芥的 2倍[1]，它們在抗病、發(fā)育、自交不親和性、植物激素的信號傳遞、器官脫落、細胞分裂和生長等過程中發(fā)揮重要作用。目前克隆的植物類受體激酶數(shù)目不多，主要來源于擬南芥、水稻、油菜和煙草等植物[1]，對植物類受體激酶的功能更是知之甚少。

植物類受體激酶主要由胞外結構域、跨膜結構域和胞內激酶結構域 3部分組成。根據(jù)胞外受體結構域的特點，植物類受體蛋白激酶可分為以下幾類：含S-結構域類(S-Domain Kinase，SRK)、富含亮氨酸類(LRR-RLK)、細胞壁連接類(Wall-associated kinase，WAK)、表皮生長因子類(Epidermal growth factor，EGF)、腫瘤壞死因子受體類(Tumor necrosis factor receptor，TNFR)和組氨酸類受體蛋白激酶[1]。其中，WAK通過細胞的伸長生長，調控側根的生長發(fā)育[2]；對玉米的Crinkly4(TNFR類)基因研究發(fā)現(xiàn)，它編碼的激酶參與調控葉表皮細胞和胚乳中糊粉細胞的分化[3]；LRR-RLKs，其胞外受體部分具有重復出現(xiàn)的富含亮氨酸的結構域，在分子識別中起重要作用[4]，如抗病基因Xa21[5]、Xa26[6]、Pi-d2[7]等屬于此類；S位點受體激酶與自交不親和反應相關[8]。

目前，采用純化蛋白質或合成多肽作為抗原免疫動物制備抗體，并用于植物中的蛋白質功能研究這一實驗手段已很常見[9-10]，但是針對植物類受體激酶的抗體還為數(shù)不多[11-12]，本研究室在對水稻類受體激酶的克隆、表達和磷酸化活性等研究的基礎上[13]，從中挑選出5個功能和類別不同的類受體激酶，分析了它們的抗原表位片段，并克隆到細菌表達載體上，進行體外的表達和純化，以純化蛋白質為抗原免疫新西蘭兔，制備抗體，為進一步研究類受體激酶的生化特性及其生物學功能提供了有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻93-11、水稻根cDNA文庫、pET-30a質粒為本實驗室保存。限制性內切酶EcoR I、BglII、Hind III購自NEB公司。ExTaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司。大腸桿菌菌株DH5α、ER2566為本實驗室保存。

1.2 抗原決定簇預測

用 BEPITOPE軟件[14]對候選RLKs基因編碼的蛋白質進行抗原表位預測，根據(jù)不同表位預測方法(疏水性、可及性、二級結構等)加和修正之后得到的一致峰圖，選出峰值較高的片段后，用 BLASTP對水稻蛋白質庫進行唯一性檢測后選出目標片段。

1.3 細菌表達載體的構建

根據(jù) NCBI公布的水稻序列設計引物，見表1。PCR擴 增 條 件 為 ：94 ℃ 4 min ；94 ℃ 1 min，58℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 1 0 min。

將pET-30a載體進行雙酶切，與PCR產(chǎn)物連接。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒進行酶切驗證。挑選出正確的重組子送北京華大基因研究中心測序驗證。

1.4 融合蛋白質的誘導表達及其大量純化

將測序正確的重組子質粒轉化大腸桿菌ER2566，挑取單菌落到 LB+Kan(50 μg/mL)培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，次日將過夜菌轉接至LB+Kan+1%葡萄糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600約為0.7，加入1 mmol/L的IPTG，37℃振蕩培養(yǎng)3 h。收集細胞沉淀，超聲后分別取上清和沉淀進行15% SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍染色觀察。

表1 Gene ID及擴增引物信息Table 1 Gene ID and information of primers

將誘導的菌液離心，在沉淀中加入 10 mmol/L Tris；再加2 mol/L尿素和10 mmol/L Tris，吹勻沉淀后離心，于沉淀中加入 0.5～1 mL 10 mmol/L Tris；再加 5～10 mL 8 mol/L 尿素+0.5 mol/L NaCl+10 mmol/L Tris，冰水浴超聲。4℃放置30 min，離心，棄上清，向沉淀中加入10 mmol/L Tris，將溶解后的樣品上樣，過鎳柱進行親和層析。上樣結束后，分別用15 mmol/L和60 mmol/L咪唑溶液洗去雜蛋白質，最后，用300 mmol/L咪唑溶液，洗脫目的蛋白質。利用15% SDS-PAGE電泳檢測，考馬斯亮藍染色觀察。

1.5 抗體的制備與檢測

將純化后并富集的重組蛋白質送至北京華大蛋白質研發(fā)中心有限公司，免疫新西蘭兔，獲得多克隆抗體。

將免疫新西蘭兔得到的抗體血清，按1∶1加入100%甘油稀釋后，以1∶5 000和1∶2 500的一抗稀釋倍數(shù)，分別與純化的重組抗原和水稻葉片蛋白質進行免疫印記檢測。

1.6 水稻葉片蛋白質的提取

用液氮研磨新鮮水稻組織至粉末狀，加入蛋白質裂解液(62.5 mmol/L Tris，pH 7.4，10%甘油，2%SDS，20 mmol/L NaF，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT)，冰水混合物中孵育10 min，4℃，12 000 r/min 離心15 min，取上清，轉移到新的1.5 mL 離心管中。

1.7 Western blotting檢測

將提取的水稻蛋白質進行SDS-PAGE后，電轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，用制備的抗體室溫孵育3 h，TTBS(2 mmol/L Tris(pH 7.6)，13.6 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20)洗膜3次，每次10 min，之后加入羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TTBS洗膜3次，每次10 min，加ECL Plus檢測液檢測，暗室X光片曝光。

2 結果

2.1 水稻 RLKs基因序列的獲得和抗原決定簇的預測

根據(jù)前期工作，挑取不同類別和功能各異的 5個水稻類受體激酶，分別為WAKs(Os04g49460)、Calcium-regulated protein kinase (CRPK1L-1)(Os01g06280、Os03g21540)、Crinkly 4_Like(Os03g43670)和 SRKs(Os01g48000)。

使用BEPITOPE軟件對5個RLKs的抗原表位進行了預測分析，選取抗原表位峰值較高的蛋白片段進行研究，由于胞外區(qū)在激酶調控過程中具有重要作用，我們最終確定的克隆片段均位于胞外區(qū)。然后進行蛋白質的唯一性檢測，確定了在CDS上的位置依次為 115～627 bp(Os04g49460)；79～531 bp(Os01g06280)；601～1023 bp(Os03g21540)；511～1 023 bp(Os03g43670)；310～852 bp(Os01g48000)(圖1)。

2.2 水稻RLKs基因片段的克隆

用水稻根的 cDNA為模板，進行 PCR，結果表明，擴增產(chǎn)物的片段大小與預測的類受體激酶基因片段的大小相符合。從轉化平板上挑取單菌落，提取質粒DNA，酶切后瓊脂糖電泳檢測。將酶切正確的重組質粒送到北京華大基因研究中心進行測序，結果證明重組子的序列是正確的(結果未顯示)。

2.3 融合蛋白質的誘導表達及其純化

對克隆得到的融合蛋白質進行了體外的誘導表達，SDS-PAGE電泳檢測結果顯示，融合蛋白質在工作濃度為1 mmol/L的IPTG的誘導條件下，在沉淀中均有大量表達(圖2)，且融合蛋白質的大小符合預測大小(22、19、17、22、25 kDa)。

通過特異識別His-Tag的beads獲得了體外純化的類受體激酶胞外區(qū)域表位片段與 6×His融合蛋白質，融合蛋白質的大小符合預測值。將純化的蛋白質過大量蛋白純化柱進行富集，當抗原的量積累到約5～10 mg時，進行洗脫，得到較純的高濃度目的蛋白質(圖3)，并用其對新西蘭兔進行免疫，制備抗體。

圖1 五個類受體激酶的抗原表位分析及克隆片段的選擇Fig.1 Epitope prediction and fragment selection ofRLKs.The domain structure predicted and analyzed by SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)and BEPITOPE.

圖2 融合蛋白質的體外誘導表達Fig.2 Expression of recombinant proteinsin vitro.0 h:control of without IPTG; S: supernatant by ultrasonic; P:pellet by ultrasonic.Os04g49460-P(22 kDa); Os01g06280-P(19 kDa); Os03g21540-S(P)(17 kDa); Os03g43670-P(22 kDa); Os01g48000-P(25 kDa).

2.4 RLKs抗體能識別重組抗原

使用制備的多克隆抗體按 1∶5 000的稀釋倍數(shù)，對細菌表達的融合蛋白質進行免疫印跡檢測。結果顯示，抗體能夠特異識別目標抗原(圖4)。

圖3 融合蛋白質的大量純化Fig.3 Purification of fusion proteinsin vitro.Os04g49460(22 kDa); Os01g06280(19 kDa); Os03g21540(17 kDa);Os03g43670(22 kDa); Os01g48000(25 kDa).

2.5 RLKs抗體在水稻葉片組織中的表達

使用RLKs抗體按1∶2 500的稀釋倍數(shù)，對水稻苗期葉片中的蛋白質進行了檢測。結果顯示，5個抗體均可識別水稻中的蛋白質。其中，抗體Os04g49460可觀察到清晰的主帶，大小與全長蛋白質的預測值80 kDa基本相符，還有一條分子量稍大的弱帶出現(xiàn)；抗體Os01g06280檢測到單一的特異條帶，大小略高于全長蛋白質的預測值97 kDa；抗體Os03g21540檢測到單一的特異條帶，大小約為60 kDa，低于全長蛋白質的預測值 97 kDa；抗體Os03g43670可見有3條清晰的條帶，其中2條帶分子量略大于全長蛋白質的預測值99 kDa，一條帶分子量較小約為50 kDa；抗體Os01g48000檢測到單一的特異條帶，大小約為60 kDa，低于全長蛋白質的預測值89 kDa(圖5)。

圖4 RLKs抗體的重組抗原檢測Fig.4 Western blotting ofRLKs antibodies with recombinant proteins.Os04g49460(22 kDa); Os01g06280(19 kDa);Os03g21540(17 kDa); Os03g43670(22 kDa); Os01g48000(25 kDa).

圖5 RLKs抗體在水稻苗期葉片中的表達Fig.5 Expression ofRLKs in shoot of rice 93-11.Os04g49460(95 kDa, 80 kDa and 60 kDa); Os01g06280(130 kDa);Os03g21540(60 kDa); Os03g43670(130 kDa, 120 kDa and 50 kDa); Os01g48000(60 kDa).

造成抗體在水稻苗期葉片組織中檢測結果與其全長蛋白質預測分子量不符這一結果的原因，很可能與蛋白質在植物體內不同的翻譯后修飾[15]以及不同的剪切形式有關。當然，這其中也不能排除蛋白質降解的因素。

3 討論

通常來講，抗體制備可以用全長的蛋白質、片段蛋白或合成多肽作免疫原，若對全長蛋白質進行克隆，難度較大，甚至有些蛋白質很難在體外表達。因此，本實驗從5個RLKs蛋白質出發(fā)，選取部分片段進行克隆表達，并獲得了純化的蛋白質。結果表明，采用這一方法可以獲得足量的高純度蛋白質用于動物免疫，得到具有較高特異性的抗體，證明了這一技術路線的可靠性[9-12]。本實驗制備完成的 5個抗體，均能特異性識別水稻葉片中的蛋白質，其中Os03g43670與馬云所做的抗體[12]一致，只是克隆的位置不同，馬云等檢測到水稻組織中的蛋白質分子量約120 kDa，與預測分子量約99 kDa存在一些差異，這主要是由于蛋白質的翻譯后修飾造成的。

細胞壁在植物的生長過程以及在遭受病原菌侵染或其他脅迫處理時發(fā)揮著重要作用，然而目前對植物細胞壁與細胞質之間信號傳遞途徑還知之甚少，WAK提供了一個研究此過程的很好的候選對象，相信深入解析 WAK的作用機制將有助于我們了解細胞壁信號的傳遞過程，也為我們了解植物細胞在生長發(fā)育和對環(huán)境刺激應答過程中的調控提供幫助[2]。SRK位于柱頭表面乳突細胞的原生質膜上，是甘藍等蕓薹屬作物柱頭識別自花花粉、啟動自交不親和信號傳導和最終導致自花花粉萌發(fā)受阻的核心關鍵酶[8,16]。已報告的 LRR-RLKs參與調節(jié)的發(fā)育過程有花器官的脫落(HAESA)、表皮細胞特化(CRINKLY4)、調控長角果的成熟發(fā)育(TMKL1)、雄性器官的發(fā)育(RPK1)等等[1]。

隨著水稻基因組序列信息的闡釋和轉錄譜數(shù)據(jù)的積累，基于抗體的蛋白質組學研究將成為現(xiàn)實。本研究以水稻為材料，克隆和表達蛋白激酶片段，純化蛋白質并進行抗體的制備，為進一步研究激酶的生化特性和功能提供了實驗依據(jù)。目前利用 5個抗體對水稻不同組織和發(fā)育時期的表達研究正在進行中。同時本實驗體系的構建對于其他植物類受體激酶的抗體制備及其功能研究具有重要的意義。

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Journals.im.ac.cn

Preparation and verification of antibodies for five rice receptor-like kinases

Bo Wang, Liyun Li, Yinghao Cao, Ziguang Liu, and Guozhen Liu
College of Life Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China

Received:December 18, 2009;Accepted:March 30, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.30670175, 30730007), National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2006CB101705).

Corresponding author:Liyun Li.Tel/Fax: +86-312-7528271; E-mail: liliyun@hebau.edu.cn國家自然科學基金項目(Nos.30670175, 30730007)，國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2006CB101705)資助。