傅俊華，王琪，尹杰超，劉銘瑤，李寧，姚文斌，任桂萍，李璐，李德山

東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 生物制藥實驗室，哈爾濱 150030

融合蛋白GST-Ulp1p在大腸桿菌中的高效可溶性表達及其活性鑒定

傅俊華，王琪，尹杰超，劉銘瑤，李寧，姚文斌，任桂萍，李璐，李德山

東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 生物制藥實驗室，哈爾濱 150030

利用基因工程技術，體外重組小分子類泛素修飾蛋白酶1(Ulp1)的活性片段，獲得高表達、高特異性重組蛋白酶。從釀酒酵母Saccharomyces cerevisia中提取Ulp1編碼第403到621個氨基酸殘基之間的DNA片段(Ulp1p)，在其C端加入6×His并連接到大腸桿菌表達載體pGEX中，構建重組表達質粒pGEX-Ulp1p-his6。將重組質粒轉化至大腸桿菌Rosetta(DE3)中，氨芐青霉素抗性篩選轉化子。表達、純化后，以SUMO融合蛋白檢測其活性。經(jīng)過優(yōu)化，該蛋白可溶性表達，表達量占菌體總蛋白的40.12%?？赏ㄟ^谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱或Ni-NTA凝膠親和層析純化得到純度98%的蛋白。經(jīng)酶切分析，比活力為1.375×104U/mg。融合蛋白GST-Ulp1p-His6無需切除谷胱甘肽S-轉移酶(GST)標簽，具有很高的活性，制備簡易；6×His標簽，有利于底物蛋白切割后純化，減少蛋白損失。本研究為制備高活力的SUMO蛋白酶提供了一個新方法。

SUMO蛋白酶1(Ulp1)，谷胱甘肽S-轉移酶(GST)，高效表達，活性鑒定

Abstract:The aim of the study is to obtain an efficient expression of recombinant ubiquitin-like specific protease 1(Ulp1)by gene engineering.We cloned the Ulp1p, active fragment(403 aa?621 aa)of Ulp1, fromSaccharomyces cerevisia, and subcloned into pGEX/Rosetta(DE3)to form an expression plasmid, pGEX-Ulp1p-His6.In order to enhance the solubility of GST-Ulp1p-His6,we purified the fusion protein GST-Ulp1p-His6by either glutathioneS-transferase agarose or Ni-NTA resin chromatography, the purity was up to 98%.We utilized the protein to cleave the SUMO fusions, and the specific activity of GST-Ulp1p-His6was 1.375×104U/mg.This study showed that the recombinant protein GST-Ulp1p-His6displayed high specificity and activity.

Keywords:ubiquitin-like specific protease 1(Ulp1), glutathioneS-transferase(GST), high-level expression, activity identification

小分子類泛素修飾蛋白(Small ubiquitin-like modifier protein，SUMO)廣泛存在于各種真核細胞中，參與調節(jié)細胞凋亡、信號轉導、RNA轉錄、蛋白的核質運輸以及細胞周期等多種生理進程[1]。由SUMO介導的蛋白質翻譯后修飾是對其所修飾的蛋白質功能與定位的一個關鍵性調節(jié)機制。近年來，SUMO被發(fā)現(xiàn)可以作為重組蛋白表達的融合標簽和分子伴侶，具有抗蛋白酶水解、顯著增加重組蛋白表達量以及促進靶蛋白正確折疊、提高可溶性等功能[2-3]。

SUMO在真核生物中的修飾作用是可逆的，經(jīng)SUMO修飾的蛋白可以通過SUMO蛋白酶切割成底物蛋白和 SUMO，這個過程為去 SUMO化(Desumoylation)[4]。至今已鑒定了 7個 SUMO蛋白酶家族成員，其定位不同，功能略有差異，具有不同的底物特異性[5]。SUMO蛋白酶在真核生物體內(nèi)主要行使2種生理功能：1)切除SUMO前體C-末端的幾個氨基酸殘基，以暴露C-末端的Gly-Gly殘基使之成為具修飾、轉運等功能的成熟 SUMO；2)將SUMO與目的蛋白偶合物水解成SUMO和目的蛋白。研究資料顯示，各種SUMO蛋白酶都含有一個保守的 C-末端 ULP結構域(約 200個氨基酸)，該結構域具有催化活性[6-7]；不同的SUMO蛋白酶有不同的N-末端結構域，正是這種差異將不同的SUMO蛋白酶定位于細胞的不同部分[8-10]。在所有 SUMO蛋白酶中，研究得最詳細的是釀酒酵母中的蛋白酶1——Ulp1。它是由621個氨基酸殘基組成的蛋白質多肽，至少含有2個結構域，一個是保守的C-端蛋白酶折疊區(qū)域(432～621 aa)；另一個是保守性弱的N-端結構域(1～432 aa)。通過序列相似性對比、結構預測和選擇性的蛋白水解實驗發(fā)現(xiàn)，Ulp1中第403～621 aa活性片段Ulp1p表現(xiàn)出具有全長的Ulp1酶切活性，并能夠水解以α-氨基連接的SUMO-目的蛋白偶合物。利用Ulp1與SUMO相互作用的晶體結構發(fā)現(xiàn)Ulp1對SUMO的識別主要依據(jù)底物的三級結構，而不像其他蛋白酶只識別特定的氨基酸序列；Ulp1的水解活性對SUMO-蛋白偶合物具有高效性和特異性，這些獨特的優(yōu)點使得 Ulp1可以作為一種新的工具酶用于重組蛋白的切割和純化。

本實驗采用pGEX表達蛋白，其優(yōu)越性之一是載體構建無需考慮SD及RBS序列對基因的轉錄和翻譯效率的影響，多克隆位點在GST基因之后，無論外源基因以何種接口插入，都不會改變這個載體的SD及RBS序列，從而表達出GST融合蛋白。其表達量雖高，但可溶性目的蛋白所占比例較小。本實驗通過對表達條件的一系列優(yōu)化，最終得到高表達、可溶的目的蛋白。本實驗在引物中設計多聚組氨酸標簽連在目的蛋白C-末端，因此在進一步的純化中，既可利用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱純化，也可通過 Ni-NTA凝膠親和層析得到純化蛋白。本研究為高效表達特異性重組可溶的SUMO蛋白酶提供了一條新的途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及主要試劑

釀酒酵母菌株購自黑龍江省微生物研究所；E.coliRosetta(DE3)由本實驗室保存；pGEX-6P-1購自Amersham Pharmacia Biotech；PMD18 T-simple-Vector購自TaKaRa；Ni-NTA Agarose購自Qiagen；蛋白分子量標準購自 Fermentas；兔抗酵母 Ulp1多抗購自 LifeSpan BioSciences；活性測定底物蛋白SUMO-IL-1β、SUMO-TNFα和 SUMO-FGF-21由本實驗室提供。

引物：P1：F 5′-CGCGGATCC ATGCTTGTTCCT GAATTAAATGA-A-3′，下劃線部分為BamH I酶切位點。P2：R 5′-CCGCTCGAG CTAGTGATGATGATGA TGATGTT-TTAAAGCGTCGGTT-3′，下劃線部分依次為XhoI酶切位點和多聚組氨酸標簽。

1.2 方法

1.2.1 Ulp1p基因的克隆及重組表達載體的構建

提取釀酒酵母基因組DNA，利用引物P1和P2進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后利用BamH I和XhoI對其進行酶切。此酶切產(chǎn)物再次經(jīng)膠回收與經(jīng)BamH I和XhoI酶切后的pGEX-6P-1載體連接，構建重組質粒pGEX-Ulp1p-His6，此質粒經(jīng)測序正確后轉化E.coliRosetta(DE3)。

1.2.2 目的蛋白的誘導表達

將轉入重組質粒 pGEX-6P-1-Ulp1p-His6的Rosetta(DE3)劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)液中(含100 mg/L氨芐青霉素)，振蕩培養(yǎng)過夜。將上述培養(yǎng)物按1%接種于LB培養(yǎng)液中(含100 mg/L氨芐青霉素)，培養(yǎng)至OD600值為0.3～0.4時加入IPTG進行誘導表達。取不同誘導溫度、誘導轉速、誘導時間及不同IPTG濃度的誘導菌經(jīng)超聲破碎后離心，將沉淀部分加入與上清相同體積的蒸餾水，取菌體上清部分及沉淀部分進行 SDS-PAGE，檢測融合蛋白的表達及可溶性情況。

1.2.3 融合蛋白GST-Ulp1p-His6的純化

取pGEX-Ulp1p-His6轉化菌大量誘導表達。誘導后的菌體用裂解緩沖液(10 mmol/L imidazole，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0)重懸后加入溶菌酶至終濃度為 1 mg/mL，冰上放置30 min后超聲破碎，10 000×g、4℃離心30 min，收集上清。上清利用 AKTA-purifier100系統(tǒng)經(jīng)過HisTrapTM FF crude親和層析，用清洗緩沖液(20 mmol/L imidazole，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0)洗去雜蛋白后，再用洗脫緩沖夜(250 mmol/L imidazole，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0)洗脫，收集唯一的洗脫峰即為融合蛋白。融合蛋白含有GST標簽，因此，也可通過谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱進行純化，將細菌用超聲波破壁后離心的上清液與50%谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠混合，15～30 min后，用過量的游離谷胱甘肽競爭洗脫。結合緩沖液(140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，pH 7.3)，洗脫緩沖夜(50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L還原型谷胱甘肽，pH 8.0)。收集的融合蛋白脫鹽后進行SDS-PAGE 電泳檢測。

1.2.4 融合蛋白GST-Ulp1p-His6的Western blotting檢測

取純化后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉移至NC膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗酵母Ulp1多抗，4℃孵育過夜。PBST洗膜3次，每次5 min。再加入HRP標記的羊抗兔IgG，37℃溫育1 h，PBST和PBS各洗膜3次后，ECL化學發(fā)光顯影。

1.2.5 融合蛋白GST-Ulp1p-His6的活性檢測

以SUMO-TNFα、SUMO-FGF-21和SUMO-IL-1β作為底物蛋白，加入GST-Ulp1p-His6和終濃度為2 mmol/L的 DTT，30℃切割 1 h，產(chǎn)物進行 SDSPAGE電泳檢測。

1.2.6 比活力的初步測定

以底物蛋白SUMO-IL-1β為例，GST-Ulp1p-His6分別以 13 μg/mL、26 μg/mL、52 μg/mL 和 78 μg/mL的終濃度對底物進行切割，2 mmol/L的DTT，30℃切割1 h，產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳檢測。以30℃下反應1 h，切割＞85%的2 μg對照底物所需要的酶量定義為一個活性單位。根據(jù)切割情況，得出酶的活力單位及比活力。

2 結果

2.1 重組質粒的構建和鑒定

利用引物P1和P2克隆產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，發(fā)現(xiàn)獲得位于500 bp和750 bp之間的單一條帶，與預期的699 bp(Ulp1p基因與酶切位點核苷酸之和)大小相符。將重組質粒 pGEX-Ulp1p-His6測序，測序結果與 GenBank上的序列(Accession No.Q02724)完全一致，證實Ulp1p基因已成功克隆并正確連接到表達載體中(圖略)。

2.2 融合蛋白表達條件的優(yōu)化

在37℃ 培養(yǎng)條件下0.25 mmol/L IPTG誘導4 h，利用pGEX-6P-1表達GST-Ulp1p-His6融合蛋白時，在分子量約53 kDa處出現(xiàn)一條新增蛋白條帶，與預期結果相符，融合蛋白主要以包涵體形式存在(圖1)，選取0.25 mmol/L IPTG誘導表達，取不同誘導溫度(37℃，20℃)、不同轉速(100 r/min，55 r/min)、不同誘導時間(1～12 h)的誘導菌進行18% SDS-PAGE，結果顯示目的蛋白的表達量達到高峰時的參數(shù)為：20℃，55 r/min，11 h。IPTG濃度為0.05 mmol/L時，上清所占比率最高。經(jīng)灰度掃描分析，表達的融合蛋白約占菌體總蛋白的40.12%(圖2)。

2.3 融合蛋白 GST-Ulp1p-His6的純化及 Western blotting鑒定

利用pGEX-6P-1載體表達外源蛋白時，融合蛋白N端含有GST標簽，可以利用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱進行純化；本實驗在目的蛋白 C-末端設計有6×His標簽，也可以利用Ni-NTA層析柱進行純化。表達菌破碎后上清經(jīng)親和層析得到唯一的洗脫峰即為 GST-Ulp1p-His6融合蛋白。蛋白樣品經(jīng) 18%SDS-PAGE電泳顯示，蛋白分子量約為53 kDa，灰度掃描結果顯示純化后成熟 GST-Ulp1p-His6純度達98%(圖3)。Western blotting分析表明，該融合蛋白可與兔抗酵母Ulp1的單抗發(fā)生特異性反應，說明表達的是SUMO蛋白酶1活性片段(圖3)。

2.4 融合蛋白GST-Ulp1p-his6的活性檢測

圖1 融合蛋白GST-Ulp1p-His6的SDS-PAGE電泳分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the fusion protein GST-Ulp1p-His6.1: uninduced cell lysate; 2, 4, 6, 8, 10, 12: supernatant of cell lysate induced by 0.25 mmol/L IPTG at 37°C for 1,2, 3, 4, 5, 6 h; 3, 5, 7, 9, 11: inclusion body induced by 0.25 mmol/L IPTG at 37°C for 1, 2, 3, 4, 5, 6 h; M: protein molecular weight marker.

圖2 融合蛋白GST-Ulp1p-His6的SDS-PAGE電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the fusion protein GST-Ulp1p-His6.M: protein molecular weight marker; 1: uninduced cell lysate; 2, 4, 6, 8, 10, 12: supernatant of cell lysate induced by 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 mmol/L IPTG at 20°C for 11 h; 3, 5, 7,9, 11, 13: inclusion body induced by 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1,2 mmol/L IPTG at 20°C for 11 h.

以SUMO-TNFα、SUMO-FGF-21和SUMO-IL-1β作為底物蛋白，加入GST-Ulp1p-His6和終濃度為2 mmol/L的 DTT，30℃切割 1 h。產(chǎn)物經(jīng) 18%SDS-PAGE電泳分析，結果顯示，SUMO-TNFα、SUMO-FGF-21和 SUMO-IL-1β能夠被 GST-Ulp1p-His6完全切割(圖4)。

圖3 純化后融合蛋白的SDS-PAGE電泳分析及Western blotting鑒定Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purification and western blotting of GST-Ulp1p-His6.M: protein molecular weight marker; 1: purified GST-Ulp1p-His6.

圖4 GST-Ulp1p-His6切割SUMO融合蛋白的SDS-PAGE電泳分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the cleavage of GST-Ulp1p-His6on SUMO-TNFα, SUMO-FGF-21 and SUMO-IL-1β.M: protein molecular weight marker; 1: SUMO-TNFα; 2: cleavage products of SUMO-TNFα; 3: cleavage products of SUMO-FGF-21; 4:SUMO-FGF-21; 5: GST-Ulp1p-His6; 6: SUMO-IL-1β; 7: cleavage products of SUMO-IL-1β.

2.5 比活力的初步測定

以 SUMO-IL-1β為底物蛋白，GST-Ulp1p-His6分別以 13、26、52、78 μg/mL的終濃度對 110 μg底物進行切割，2 mmol/L DTT，在150 μL酶切緩沖液中30℃反應1 h，產(chǎn)物進行18% SDS-PAGE電泳檢測。結果顯示，分子量為37 kDa的SUMO-IL-1β被切割為 20 kDa的 SUMO和 17 kDa的 IL-1β。26 μg/mL的酶切割＞85%的底物蛋白。根據(jù)酶活力定義，酶活力單位為5.5 U/μL，比活力為1.375×104U/mg(圖5)。

圖5 不同酶濃度切割SUMO-IL-1β的SDS-PAGE電泳分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the cleavage of different concentration of GST-Ulp1p-his6on SUMO-IL-1β.M: protein molecular weight marker; 1: GST-Ulp1p-His6; 2: SUMO-IL-1β;3?6: concentrations of GST-Ulp1p-His6were 13, 26, 52,78 μg/mL for cleavage of SUMO-IL-1β.

3 討論

溫度對于融合蛋白 GST-Ulp1p-His6的誘導表達有一定的影響。在實驗過程中，37℃培養(yǎng)條件下，融合蛋白全部以包涵體形式存在。隨著培養(yǎng)溫度的下降，其可溶性表達的情況則越來越好，但是表達量會有所下降，20℃誘導表達時，融合蛋白均為上清表達，表達量可以達到菌體總上清蛋白的 40.12%。IPTG的濃度也影響表達量及可溶情況，從本實驗看，IPTG濃度越小，表達量反而越高，上清所占比例也越大，可能是IPTG的毒性殺死細胞，同時也會增加外源蛋白表達速度，容易造成包涵體的形成。該酶含有GST標簽，可以通過谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱進行純化，蛋白純化條件溫和，有利于保持蛋白活性。許多用基因工程菌株生產(chǎn)的外源蛋白由于在提取和純化過程中加入變性劑而改變了蛋白質的空間構象，因而即使保持了正確的一級結構，也不能表現(xiàn)出生物活性或活性很低。而GST融合蛋白，可以直接從細菌裂解液中用固定化谷胱甘肽將它吸附，洗脫條件溫和，整個過程無變性劑的加入，最大限度地保持了蛋白的天然構象。在GST融合蛋白的原核表達系統(tǒng)中(例如pGEX系列)，GST融合蛋白經(jīng)常處于不可溶狀態(tài)。本實驗采用低溫慢速，低IPTG濃度過夜誘導，使得上清比例達到90%，幾乎全部為可溶性蛋白。同時，該酶還設計有多聚組氨酸標簽，通過Ni-NTA凝膠親和層析得到純化蛋白。通過兩種方式獲得的蛋白純度均高達98%，無明顯差別，可根據(jù)實驗條件自行選擇。酶切產(chǎn)物在經(jīng)過Ni-NTA凝膠親和層析以去掉SUMO和蛋白酶時，由于帶有His標簽，故可與SUMO同時被洗脫下來，從而節(jié)省了洗脫步驟，避免了長時間反復操作而影響蛋白活性。

該融合蛋白酶具有GST標簽，可增加其表達量。本研究發(fā)現(xiàn)，在酶切反應中，融合的GST-SUMO蛋白酶即具有酶切活性，且活性很高，這在目前的研究中尚屬罕見。如切掉GST標簽，則需要凝血酶或凝血因子在特異性位點上切除，而該凝血酶價格昂貴，不利于節(jié)約成本；且再次切割會影響蛋白收率及活性。本研究無需切掉GST標簽，便具有酶切活性，開辟了制備高活力蛋白酶的新途徑。

SUMO蛋白酶能夠識別完整的SUMO標簽蛋白序列，并能高效地把SUMO從融合蛋白上切割下來。由于其識別序列較長，所以SUMO蛋白酶酶切反應有很高的特異性，而且切割后得到的目的蛋白不含任何多余氨基酸，不會影響目的蛋白的活性，這對于那些N末端對活性影響較大的蛋白質的表達是極其重要的。同時SUMO蛋白酶進行切割時識別的是底物的三級結構，避免了由于切割傳統(tǒng)融合標簽的蛋白酶識別的氨基酸序列一般較短而可能在目的蛋白內(nèi)部進行的錯誤切割[11]。

利用SUMO融合表達系統(tǒng)表達重組蛋白，在分離靶蛋白過程中，必須使用SUMO蛋白酶作為切割工具。本實驗成功構建并高效表達了可溶性融合蛋白GST-Ulp1p-His6，并可以切割各種SUMO融合蛋白，在本實驗室得到廣泛應用。由于SUMO蛋白酶市場價格仍然昂貴，因此，大量表達高活力和高特異性的重組SUMO蛋白酶具有十分重要的經(jīng)濟意義和市場價值。

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Expression and characterization of soluble recombinant Ulp1p with glutathione S-transferase tag in Escherichia coli

Junhua Fu, Qi Wang, Jiechao Yin, Mingyao Liu, Ning Li, Wenbin Yao, Guiping Ren, Lu Li,and Deshan Li
Biopharmaceutical Laboratory, College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

Received:January 8, 2010;Accepted:March 17, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.30700591).

Corresponding author:Deshan Li.Tel: +86-451-55190645; E-mail: Deshanli@163.com國家自然科學基金(No.30700591)資助。