陳慧梅，曹廣力，薛仁宇，貢成良

蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院，蘇州 215123

非轉(zhuǎn)座子載體介導的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化家蠶BmN細胞表達人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子

陳慧梅，曹廣力，薛仁宇，貢成良

蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院，蘇州 215123

為了建立非轉(zhuǎn)座子載體介導的持續(xù)表達外源基因的轉(zhuǎn)化家蠶BmN細胞系，將家蠶核型多角體病毒極早期基因(ie-1)啟動子控制的人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的表達盒克隆至 pIZT/V5-His，獲得重組載體pIZT-IE-hGM-CSF，該載體轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞后，通過博萊霉素(Zeocin)篩選獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞系IE-hGM-CSF。轉(zhuǎn)基因細胞基因組經(jīng)PCR鑒定，成功檢測到ie-hGM-CSF，Western blotting分析結果顯示轉(zhuǎn)化細胞表達的重組hGM-CSF的大小為22 kDa，ELISA檢測結果顯示hGM-CSF在轉(zhuǎn)化細胞系里的表達水平大約為2 814.7 pg/106個細胞。

轉(zhuǎn)化，pIZT/V5-His，hGM-CSF，BmN細胞

Abstract:To develop the stable transformants of the silkworm(Bombyx mori)BmN cells that could continuously express the exogenous gene based on a non-transposon vector, an expression cassette containing human granucyto-macrophage colony-stimulating factor(hGM-CSF)gene driven byie-1 promoter fromB.morinucleopolyhedrovirus was inserted into pIZT-V5-His to form a recombinant vector pIZT-IE-hGM-CSF, followed by transfecting the constructant into BmN cells, the stable ie-hGM-CSF cell lines were obtained after being selected with Zeocin.PCR result using the genomic DNA of the transformed BmN cells as template illustrated a specific fragment ofie-hGM-CSF, and Western blotting analysis using an antibody against hGM-CSFdemonstrated a specific band with a molecular weight of 22 kDa in the transformed cells,meanwhile, the expression level of hGM-CSF determined by ELISA was about 2 814.7 pg in 106transformed BmN cells.

Keywords:transformation, pIZT/V5-His, hGM-CSF, BmN cells

目前主要通過大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞以及哺乳動物細胞 4種系統(tǒng)來表達外源蛋白[1]，這 4大表達系統(tǒng)在科學研究、新藥研發(fā)等方面發(fā)揮了巨大的作用。大腸桿菌表達系統(tǒng)屬于原核表達系統(tǒng)，具有良好的操作性、成本低等優(yōu)點，但重組蛋白不能進行翻譯后修飾加工，難以獲得高活性的目的蛋白；酵母表達系統(tǒng)屬于低級的真核表達系統(tǒng)，可以進行翻譯后加工修飾，但發(fā)生錯誤修飾的機率較高；哺乳動物細胞表達系統(tǒng)經(jīng)過加工修飾表達的外源蛋白與天然蛋白結構最為接近，但表達量不高，并且培養(yǎng)哺乳動物細胞成本高、操作復雜。昆蟲細胞表達系統(tǒng)操作簡單，易培養(yǎng)，成本相對較低，并且可以進行糖基化等修飾，可以生產(chǎn)得到高活性的外源蛋白。昆蟲表達一般采用桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(BEVS)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化表達系統(tǒng)。BEVS是一種瞬時表達系統(tǒng)，昆蟲細胞會因為病毒感染而死亡，外源基因不能實現(xiàn)連續(xù)、傳代表達，另外盡管桿狀病毒進入哺乳動物細胞不能產(chǎn)生有效感染，但目前仍未排除桿狀病毒對宿主潛在的危害[2-3]，而通過昆蟲轉(zhuǎn)化細胞表達外源基因其表達水平較低，約為BEVS的1%[4]，但是通過轉(zhuǎn)化昆蟲細胞克服了BEVS的一些缺點，它是一種永久性的表達系統(tǒng)，形成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系細胞可以持續(xù)、傳代培養(yǎng)，并且昆蟲細胞的安全性比BEVS的要高許多。目前已有一些獲得穩(wěn)定昆蟲細胞系的報道[5-7]，但有關家蠶穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞報道卻不多見[7]。Jarvis等[4]利用苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californicamulticapsid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)ie-1啟動子控制 β-半乳糖苷酶基因表達元件的轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染Sf-9細胞，通過抗生素G418篩選，獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞系，并且經(jīng)過多次傳代后，外源基因仍能穩(wěn)定表達；Cherbas等[5]通過相似的方法同樣獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化果蠅Drosophila melanogaster細胞系；趙越等[8]用攜帶neo、綠色熒光蛋白(gfp)及家蠶絲膠基因啟動子(Pser-1)驅(qū)動人胰島素樣生長因子(hIGF-Ⅰ)表達的基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞，經(jīng)過G418的篩選，獲得了可以穩(wěn)定表達hIGF-Ⅰ的轉(zhuǎn)化細胞系。

人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)是第1個被克隆和利用重組DNA技術生產(chǎn)的一種造血生長因子，能夠刺激T細胞和巨噬細胞增殖、成熟和分化，具有極其重要的免疫調(diào)解功能，在造血調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，因此具有十分重要的臨床應用價值[9]。目前市場上銷售的hGM-CSF多是通過大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)的重組蛋白，探討 hGM-CSF的新表達方法對重組 hGM-CSF的生產(chǎn)有重要經(jīng)濟意義。

pIZT/V5-His是Invitrogen公司開發(fā)的一種能用于昆蟲 Sf9細胞穩(wěn)定表達外源基因的載體，該載體可隨機多拷貝整合至昆蟲細胞的基因組內(nèi)，并且載體含有博萊霉素(Zeocin)抗性基因和綠色熒光蛋白(gfp)基因融合表達盒。利用該載體通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化Sf9細胞表達外源基因已有一些研究[10-12]，但用于家蠶BmN細胞的研究還不多見。目前BmN細胞廣泛用于家蠶基因功能的鑒定、重組蛋白的表達、家蠶核型多角體病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovius，BmNPV)的分子生物學研究等。它屬于真核表達系統(tǒng)，具有細胞易培養(yǎng)、重組蛋白的后加工比較完善等優(yōu)點。為了檢測 pIZT/V5-His載體介導的轉(zhuǎn)化家蠶細胞表達外源基因的能力，本研究將ie-1啟動子控制的hGM-CSF表達盒克隆至pIZT/V5-His載體，獲得了重組轉(zhuǎn)基因載體 pIZT-IE-hGM-CSF，家蠶BmN細胞轉(zhuǎn)染該載體后，通過Zeocin篩選獲得了穩(wěn)定表達hGM-CSF的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞系，為利用家蠶細胞表達外源基因提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

載體pIZT/V5-His購自Invitrogen公司。帶有桿狀病毒極早期啟動子ie-1控制的 hGM-CSF表達盒的重組質(zhì)粒 pSK-IE-hGM-CSF[13]、宿主菌E.coliTG1、家蠶卵巢來源的BmN細胞系均由蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院生物化學與分子生物學實驗室保存。限制性內(nèi)切酶、PCR相關試劑、T4 DNA連接酶等購自 Fermentas公司。X-gal、IPTG、20×PBS等購自上海生物工程技術服務有限公司。凝膠回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。hGM-CSF ELISA kit購自 USCN Life Science &Technology Company。兔抗 hGM-CSF抗體、HRP標記的羊抗兔IgG購自北京博奧森公司。TC-100昆蟲細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Lipofectin、博萊霉素均購自Invitrogen公司。

1.2 引物

參照 GenBank中的 BmNPV-T3株基因組全序列(Accession No.L33180))的/ie-1基因啟動子區(qū)域序列和hGM-CSF基因序列，設計引物 p1(5′-CGGGTACC GATTTGCAGTTCGGGAC-3′，下劃線表示EcoRⅠ酶切位點)、p2(5′-CGGAATTCC ACTCCTGGACTGGCTCCC-3′，下劃線表示KpnⅠ酶切位點)，以及 hGM-CSF-1(5′-TGGATATCATGT GGCTGCAGAGCCTGC-3′，下劃線表示EcoR V酶切位點)、hGM-CSF-2(5′-ATCTCGAGAAGCTTAT CACTCCTGGACTGGCTCCC-3′，下劃線表示XhoI、Hind Ⅲ酶切位點)，引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 轉(zhuǎn)基因載體PIZT-IE-hGM-CSF的構建

以質(zhì)粒pSK-IE-hGM-CSF為模板，以p1/p2為引物，通過PCR擴增ie-hGM-CSF片段(約1 kb)。擴增條件為：94℃預變性 5 min；95℃ 50 s，52℃50 s，72 ℃ 1 .5 min ，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳、割膠回收后，用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切，與經(jīng)同樣酶切的 pIZT/V5-His載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTG1的感受態(tài)細胞中，在含有博萊霉素的 LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選單菌落，快抽質(zhì)粒進行 PCR鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pIZT-IE-hGM-CSF。該載體的結構如圖1所示。

圖1 轉(zhuǎn)基因載體PIZT-IE-hGM-CSF的結構示意圖Fig.1 Schenmatic diagram of transgenic vector PIZT-IE-hGM-CSF.OpIE1: IE1 promoter of OpNPV;gfp: green fluorescent protein gene; Zeocin: Zeocin resistance gene;SV40pA: polyA signal of SV40; OpIE2: IE2 promoter of OpNPV; IEpro: IE1 promoter.

1.3.2 家蠶BmN細胞的轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化細胞的篩選

家蠶BmN細胞用含10%胎牛血清的TC-100在26℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染方法參考文獻[14]中的方法進行。轉(zhuǎn)染24 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光細胞，4 d后，更換細胞培養(yǎng)基，同時添加博萊霉素至終濃度30 mg/L，連續(xù)篩選1個月，期間觀察綠色熒光細胞的比例。當綠色熒光細胞達80%以上時，收集細胞，抽提基因組進行鑒定。

1.3.3 hGM-CSF表達的檢測

當綠色熒光細胞比例達70%以上時，棄細胞培養(yǎng)液，加1 mL 1× PBS反復吹打細胞，吸取細胞懸浮液，并用血球計數(shù)板計數(shù)，?20℃反復凍融3次后，10 000 r/min、4℃離心 10 min，取上清，稀釋5倍，按照 ELISA試劑盒的使用說明測定 hGM-CSF的表達水平，重復 2次。剩余的上清加 2倍體積的無水乙醇，?20℃冷凍1 h，12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清，加30 μL的1× PBS溶解，與上樣緩沖液混合后，100℃水浴5 min，離心后取上清進行 SDS-PAGE(濃縮膠為 5%，分離膠為15%)和Western blotting分析，Western blotting用兔抗 hGM-CSF為一抗，HRP標記的羊抗兔 IgG為二抗。

2 結果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因載體pIZT-IE-hGM-CSF的鑒定

構建的質(zhì)粒 pIZT-IE-hGM-CSF用EcoRⅠ、KpnⅠ進行雙酶切，可檢測到約1 kb的特異性條帶；以 pIZT-IE-hGM-CSF為模板，p1/p2為引物，進行PCR鑒定，可擴增出約1 kb的特異性條帶，另外對載體進行測序，各種結果均表明轉(zhuǎn)基因載體pIZT-IE-hGM-CSF已構建成功。

2.2 pIZT-IE-hGM-CSF介導的轉(zhuǎn)化細胞篩選與鑒定

pIZT-IE-hGM-CSF轉(zhuǎn)染BmN細胞24 h后，在熒光顯微鏡下可以明顯觀察到部分細胞呈綠色熒光(圖2A)，表明質(zhì)粒DNA已進入細胞內(nèi)，gfp基因已正確表達；轉(zhuǎn)染4 d后開始用博萊霉素篩選，隨著篩選時間的延長，熒光細胞比例逐漸增加。1個月后，熒光細胞比例可達 70%以上(圖2B)，表明Zeocin抗性基因以及GFP基因已正確表達。并可在維持這一熒光比例的情況下穩(wěn)定傳代大約10次(圖2C)，所獲的轉(zhuǎn)化細胞系命名為IE-hGM-CSF。為了鑒定外源DNA是否已整合至細胞基因組，以抗生素篩選2個月的熒光細胞基因組為模板，分別以p1/p2和 hGM-CSF-1/hGM-CSF-2為引物，可分別檢測到約1 kb和430 bp的特異性產(chǎn)物，表明ie-1啟動子控制的hGM-CSF基因已整合進細胞基因組(圖3)。

圖2 轉(zhuǎn)染pIZT-IE-hGM-CSF后經(jīng)zeocin篩選的轉(zhuǎn)化BmN細胞Fig.2 Transformed cells screened from BmN cells transfected with pIZT-IE-hGM-CSF by using Zeocin.(A)24 hours after transfection.(B)One month after transfection.(C)Two months after transfection.

2.3 SDS-PAGE和Western blotting檢測

為了分析hGM-CSF在轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)的表達情況，收集博萊霉素篩選 2個月的轉(zhuǎn)化細胞進行SDS-PAGE分析，未檢測到Zeocin-GFP和hGM-CSF特異性條帶，而Western blotting檢測結果顯示，在22 kDa處有明顯的特異性條帶出現(xiàn)(圖4)，表明hGM-CSF已在轉(zhuǎn)化細胞中正確表達。

2.4 ELISA檢測轉(zhuǎn)基因細胞中hGM-CSF的表達水平

根據(jù)hGM-CSF標準品的ELISA檢測數(shù)據(jù)制作標準曲線(圖5)，取轉(zhuǎn)化細胞用ELISA試劑盒檢測hGM-CSF的表達，由標準曲線計算結果：hGM-CSF在轉(zhuǎn)基因 BmN細胞中的表達水平為 2 814.7 pg/106個細胞，而正常BmN細胞中基本未檢測到。

圖3 轉(zhuǎn)化BmN細胞基因組的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of transformated BmN cells.M:DNA marker; 1: detection of IE-hGM-CSF from the genome of transformated cells; 2: detection of hGM-CSF from the genome of transformated cells; 3,4: detection of hGM-CSF and IE-hGM-CSF from the genome of normal cells.

圖4 轉(zhuǎn)化細胞的SDS-PAGE及Western blotting分析Fig.4 SDS-PAGE and Western blotting analysis of transformed cells.M: protein marker; 1,2: SDS-PAGE detection of normal BmN cells and transformed cells respectively; 3,4:Western blotting detection of nomal BmN cells and transformated cells, respectively; the concentrations of the stacking gel and the separating gel were 5% and 15%,respectively; the primary antibody was rabbit anti-hGM-CSF and the secondary antibody was HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG.

圖5 ELISA檢測hGM-CSF標準曲線Fig.5 Calibration curve of hGM-CSF tested by ELISA.

3 討論

利用轉(zhuǎn)化昆蟲細胞表達外源基因雖然沒有BEVS的表達水平高[2]，但是轉(zhuǎn)化昆蟲細胞表達系統(tǒng)具有它自身的優(yōu)勢。例如，BEVS系統(tǒng)中外源基因的表達多數(shù)在病毒感染細胞的晚期，這時的細胞狀態(tài)已經(jīng)異常，往往致使表達產(chǎn)物不能得到有效的翻譯后加工，從而導致表達產(chǎn)物的活性不高[15]。而通過昆蟲轉(zhuǎn)化細胞表達，整個過程沒有病毒DNA的污染和病毒蛋白的表達，得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞系可以穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，并且整個表達過程都是在細胞狀態(tài)良好的情況下進行的，這樣不僅使得產(chǎn)物的安全性大大提高，而且還可以使產(chǎn)物得到更加有效的加工，提高了產(chǎn)物的活性，如果借助無血清細胞培養(yǎng)和分泌表達技術，表達產(chǎn)物極易純化，并且可以滿足工業(yè)上的大規(guī)模培養(yǎng)要求。

目前轉(zhuǎn)化昆蟲細胞載體多是轉(zhuǎn)座子載體和非轉(zhuǎn)座子載體，其中包含有P轉(zhuǎn)座子、mariner轉(zhuǎn)座子、piggyBac等轉(zhuǎn)座子，其中在昆蟲個體及昆蟲細胞中piggyBac轉(zhuǎn)座子應用較為成熟。piggybac屬于Ⅱ類可移動元件，首次從粉紋夜蛾Trichoplusia niTN-368細胞系中分離[16]，它已被廣泛應用于轉(zhuǎn)化昆蟲細胞及轉(zhuǎn)基因家蠶研究。李曦等[17]構建了pigA3GFP-IE-neo-FH-hGM-CSF-polyA–fib-L-intron1，然后轉(zhuǎn)化家蠶BmN細胞，并通過G418篩選獲得了穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)化BmN細胞系，不過外源基因表達水平不高；趙越等[8]構建了基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的載體，成功獲得轉(zhuǎn)基因家蠶并表達外源基因人胰島素樣生長因子(hIGF-Ⅰ)；薛仁宇等[18]同樣構建了piggyBac轉(zhuǎn)座子的載體，包含有新霉素抗性基因(neo)、gfp、hIGF-Ⅰ。

pIZT/V5-His是Invitrogen公司開發(fā)的一種能在昆蟲Sf9細胞中穩(wěn)定表達外源基因的非轉(zhuǎn)座子載體，該載體利用黃杉毒蛾核型多角體病毒(Orgyia pseudotsugatanucleopolyhedrovirus，OpNPV)的ie-1和ie-2啟動子分別控制Zeocin-GFP的融合表達與外源基因的表達，當構建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，通過一定濃度的博萊霉素篩選可獲得穩(wěn)定表達外源基因的細胞系。目前該載體已經(jīng)廣泛應用于各種外源基因的表達，Wang等[10]將鱟屬的 C因子的基因克隆至載體pIZT/V5-His然后轉(zhuǎn)染Sf9細胞，實現(xiàn)了該基因的穩(wěn)定表達；孫延波等[11]構建重組載體pIZT/V5-His-mlL-4，轉(zhuǎn)染 Sf9細胞，獲得了穩(wěn)定表達的細胞系；韓鳳麗等[19]把對蝦的酚氧化酶原基因克隆進入載體 pIZT/V5-His，然后誘導大腸桿菌BL21，使得酚氧化酶原基因成功表達。由此可以看出該載體可以在多種不同種類細胞中表達不同種類的蛋白。本研究中，hGM-CSF在BmN細胞中穩(wěn)定表達表明OpNPV的ie-1啟動子在家蠶BmN細胞中也具有活性，pIZT/V5-His可以用于在家蠶BmN細胞中表達外源基因，進一步可以推測該載體也有可能用于昆蟲種系轉(zhuǎn)化研究。

該載體轉(zhuǎn)染時與piggybac不同，轉(zhuǎn)化過程不需要輔助質(zhì)粒，直接將重組的載體加脂質(zhì)體配成轉(zhuǎn)染液即可進行轉(zhuǎn)染，并且隨機插入宿主基因組，轉(zhuǎn)染效率高，24 h之內(nèi)即可看到綠色熒光細胞。Piggybac轉(zhuǎn)座子一般在宿主基因組的TTAA處插入[13,18,20-22]，迄今為止還沒有關于載體 pIZT/V5-His插入具有偏愛性的報道，該方面還需要進一步研究。從轉(zhuǎn)染細胞熒光觀察結果顯示，不同轉(zhuǎn)化細胞所表現(xiàn)的綠色熒光強度存在明顯差異，這可能是gfp表達元件在不同細胞中的拷貝數(shù)不同或由于整合在細胞基因組的位置不同從而表達水平不同。由此可以推測，通過對外源DNA插入?yún)^(qū)域的基因序列分析，有可能會獲得新的增強子或者沉默子。

BmN細胞大約 3 d傳代 1次。本研究用質(zhì)粒pIZT-IE-hGM-CSF轉(zhuǎn)染BmN細胞，24 h后可觀察到一小部分綠色熒光細胞，隨著使用Zeocin抗生素的篩選，熒光細胞比例逐漸增加，從圖2可看出，到1個月時熒光細胞可達 70%以上，我們在該基礎上繼續(xù)篩選至 2個月，綠色熒光細胞可以維持該比例穩(wěn)定遺傳。gfp在細胞傳代大約10次后不但沒有減弱，而且可以比較穩(wěn)定地遺傳。由此可以初步表明外源基因不是游離的，而是成功整合進了細胞的基因組內(nèi)。

從本研究的Western blotting結果可以看出，轉(zhuǎn)化細胞系在大約22 kDa處檢測到特異性條帶，而正常的BmN細胞樣品則沒有檢測到，條帶大小比大腸桿菌中表達的hGM-CSF的分子量(16.3 kDa)稍大，而與桿狀病毒介導的hGM-CSF在BmN中表達的分子量是一致的，這可能是hGM-CSF產(chǎn)物在家蠶細胞中經(jīng)過翻譯后修飾的結果。這些結果說明外源基因hGM-CSF在轉(zhuǎn)基因細胞中得到了成功表達，從而推測該載體也可用于轉(zhuǎn)基因家蠶的研究。通過本研究中SDS-PAGE及ELISA的實驗結果看出，hGM-CSF在BmN細胞中的表達水平很低，提高外源基因的表達水平仍是一個急需解決的問題。我們設想通過提高外源基因拷貝數(shù)，使用增強子增強外源基因的表達水平，篩選表達水平高的細胞克隆，并通過分泌表達等方法來提高外源基因的表達水平。

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Expression of hGM-CSF in transformed silkworm BmN cells mediated by non-transposon vector

Huimei Chen, Guangli Cao, Renyu Xue, and Chengliang Gong
College of Pre-clinical Medical and Biological Science, Soochow University, Suzhou 215123, China

Received:January 5, 2010;Accepted:April 9, 2010

Supported by:National Key Basic Research Program of China(973 Program)(No.2005CB121000), Key Fostering Projec for Application Research of Soochow University(No.Q3134991).

Corresponding author:Chengliang Gong.Tel/Fax: +86-512-65880183; E-mail: gongcl@suda.edu.cn國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目(973計劃)(No.2005CB121000)，蘇州大學重大應用研究培育項目(No.Q3134991)資助。