楊 明, 沈 楊, 許 海, 王昆鵬, 吳明紅

(上海大學環(huán)境與化學工程學院,上海 200444)

兩種濃縮方法在水樣脊髓灰質病毒檢測中的應用

楊 明, 沈 楊, 許 海, 王昆鵬, 吳明紅

(上海大學環(huán)境與化學工程學院,上海 200444)

水樣中病毒顆粒的有效濃縮和富集是病毒檢測的首要任務.分別應用氯化鈉-氯化鋁沉淀法和濾膜吸附法,對模擬水樣和實際水樣的脊髓灰質病毒進行濃縮分離.經過核酸提取后,通過 RT-nest-PCR分子生物學技術擴增特異性核酸片段檢測病毒,結果發(fā)現(xiàn),兩種濃縮方法對水樣中的脊髓灰質病毒都能有效地回收富集及檢測.通過計算,分別檢測到污水處理廠進水口中病毒存在所用水樣的有效體積,氯化鈉-氯化鋁沉淀法為 3.5 mL,濾膜吸附法為2.1 mL.應用氯化鈉-氯化鋁沉淀法對另外 3個污水處理廠水樣的病毒檢測發(fā)現(xiàn),進水口和出水口均有脊髓灰質病毒的存在.另外,制備了包含脊髓灰質病毒特異性核酸片段的陽性質粒標準品,為開展水體環(huán)境中有害病毒的檢測工作奠定研究基礎.

氯化鈉-氯化鋁沉淀法;濾膜吸附法;腸道病毒;逆轉錄 PCR;巢式 PCR

Abstract:Effective enrichment and recovery of virus particles from water is the p rimary task in virus detection in water samples.The present study used sodium chloride-aluminum chloride precipitation method and cation-coated filter method to concentrate polioviruses from a simulated virus contaminated water samp le and a real untreated water samp le collected from a sewage treatment p lant in Shanghai.RNA was extracted from concentrated viruses and then reverse transcrip tion-PCR(RT-PCR)and nest PCR were perfomed.The results revealed that polioviruses could be detected from the real water sample by meansof two concentration methods,indicating that viruses had been effectively recovered from water by those two methods.Thepresenceof polioviruseswasdetected from virtual volume of 3.5 mL untreated water sample using sodium chloride-aluminium chloride precipitation method and from virtual volume of 2.1 mL untreated water sample using cation-coated filter method.We also found the presence of polioviruses in the influent and effluent water samples collected from another three sewage treatment p lants using sodium chloride-aluminium chloride p recip itation method and RT-nest-PCR detection. In addition,a recombinent plasmid containing poliovirus-specific fragmentwas constructed and prepared asa positive experimental control for the further poliovirusdetection.Our study p rovided p reliminary data for applicationsof the two differentmethods for virus concentration in water samples and observed potential enteroviruspollution in aquatic environment in Shanghai.

Key words:NaCl-AlCl3precipitation method; cation-coated filter method; enterovirus; reverse transcrip tion-PCR(RT-PCR);nest PCR

污染水體中存在著大量的有機物質,適于各種微生物的生長,因此,污染水體是僅次于土壤的第二種微生物天然培養(yǎng)基[1].水體中的微生物主要來源于土壤以及人類和動物的排泄物,其中病毒的種類包括腸道病毒、腺病毒、肝炎病毒、輪狀病毒、星狀病毒和諾如病毒等.水環(huán)境污染或水系傳播而引起的病原體感染是當今世界危害范圍最廣的環(huán)境問題[2].全世界每年由于腸道感染引起痢疾的病例多達 40億例次,死亡人數多達 220萬,成為全球疾病之首[3].因此,對飲用水、環(huán)境水源乃至各級污水中污染病毒的檢測,是預防控制疾病,評估水源衛(wèi)生質量、環(huán)境衛(wèi)生情況的一項有價值的工作[4].

腸道病毒的常規(guī)檢查方法主要有細胞培養(yǎng)法和免疫學方法等.這些方法檢測步驟繁瑣,操作復雜,檢測所需時間較長,而逐漸被分子生物學檢測水中病毒的方法所替代.該方法檢測水體病毒具有快速、特異性強、靈敏性高的特點,一般分為如下幾個步驟:病毒的濃縮和分離、病毒核酸的純化和提取、病毒核酸的檢測.在實踐中,對水樣中病毒顆粒的有效濃縮和富集是病毒檢測的首要任務.常用的水樣中腸道病毒的濃縮方法有免疫學反應法、吸附-洗脫法、過濾法、沉淀法等[5],其中吸附洗脫法和絮凝沉淀法是最主要的方法.絮凝沉淀法利用化學物質的絮凝作用,操作簡單,應用廣泛;膜吸附-洗脫法則利用病毒的膠體性質和蛋白質特性,該方法在國外研究中應用較多[6].目前,國內對水環(huán)境中病毒的檢測研究不多[7-12],但是,隨著公眾對水體環(huán)境安全的日益重視,病毒檢測必不可少.本研究分別采用氯化鈉-氯化鋁沉淀法[13-14]和濾膜吸附法[15-16]兩種方法,對模擬水樣和實際水樣的脊髓灰質病毒進行濃縮富集,應用分子生物學技術檢測特異性核酸片段,并制備陽性質粒標準品,為今后開展水體環(huán)境中有害病毒的檢測工作奠定研究基礎.

1 實驗材料與方法

1.1 材料

脊髓灰質炎減毒活疫苗 (猴腎細胞),中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所.模擬水樣由 500 mL無菌去離子水中人工添加 0.2 mL脊髓灰質炎減毒活疫苗獲得,實際水樣取自上海市某污水處理廠 (A廠)的進水口水樣,檢測水樣分別取自上海市 3個污水處理廠 (B廠、C廠和 D廠)的進水口和出水口.A廠、B廠污水處理能力 <5×104m3/d,C廠、D廠污水處理能力≥2×105m3/d.

病毒 RNA提取試劑盒 (TIANamp Virus RNA Kit),天根生化科技有限公司;PrimeScrip tTMOne Step RT-PCR kit、ExTaq熱啟動聚合酶、PMD18-T質粒連接試劑盒、E.coli HB101感受態(tài)細胞、DL 2000 DNA Marker等,寶生物工程有限公司;凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒,上海生物工程有限公司;0.45μm HA過濾膜 (直徑 47 mm)、YM-50超濾管,M ILL IPORE公司;實驗所用引物[17],上海生物工程有限公司合成,核酸序列如表 1所示;氯化鈉、六水合氯化鋁、無水乙醇等試劑等均為國產分析純,國藥集團化學試劑有限公司.

表 1 引物序列Table 1 Sequence of pr imer s

1.2 實驗方法

1.2.1 水中病毒的濃縮分離方法

1.2.1.1 氯化鈉-氯化鋁沉淀法

在待檢水樣中加入氯化鈉顆粒和六水氯化鋁溶液,使其終濃度分別達到 1%和 0.005～0.010 mol/L;4℃靜置過夜后,4℃5 000 r/min離心15 min;棄上清,沉淀物用 1 mL甘氨酸-EDTA緩沖液洗脫;4℃1 500 r/min離心 10 min,取上清,置于 1.5 mL離心管中,-20℃凍存待檢.

后來，學者們繼續(xù)提出了適用于文化系統(tǒng)迥異的不同民族的文學研究的“闡發(fā)研究”和特別關注一國作家或作品在其他國家的接受情形的比較文學的“接受研究”。

1.2.1.2 濾膜吸附法

待檢水樣過濾膜前,先用 5 mL 250 mmol/dm3氯化鋁溶液潤洗濾膜,使其帶正電荷;然后將 500mL待測水樣、200 mL 0.5 mmol/dm3硫酸依次通過濾膜;棄濾液,再用 10 mL 1.0 mmol/dm3氫氧化鈉溶液洗脫病毒;收集濾液,加入 50μL 100 mmol/dm3硫酸和 1 mL 10×Tris-EDTA(TE)緩沖液.將上述溶液加入 YM-50超濾管中,20℃,5 000 g離心10 min,收集濃縮液約 500μL,置于 1.5 mL離心管中,-20℃凍存待檢.

1.2.2 病毒 RNA的提取

病毒 RNA提取按照試劑盒說明書進行.取 140 μL病毒濃縮液加入至含有 560μL carrier RNA工作液的 1.5 mL的 RNase free的滅菌離心管中,渦旋震蕩 30 s;室溫孵育 15 min,加入 560μL無水乙醇,渦旋震蕩 30 s,轉移至包含吸附柱的收集管裝置中;8 000 r/min離心 1.5 min,棄廢液,依次加入清洗液重復離心操作;棄廢液,室溫放置 5 min;加入 60μL RNase free dd H2O,室溫放置 5 min;8 000 r/min離心 1.5 min,收集病毒 RNA.

1.2.3 病毒核酸的 RT-nest-PCR檢測

取待檢 RNA樣品 (0.5～1.0μg),按照一步法RT-PCR反轉錄試劑盒操作說明書,依此加入 25μL 2×1 Step Buffer,2μL PrimeScrip t 1 Step Enzyme Mix,通用正向引物 20 pmol,反向外側引物 20 pmol,加入 RNase free dd H2O補足至終體積為 50μL.在PCR儀上按照以下程序完成一步法 RT-PCR反應:50℃30 min,94℃預變性 2 min;94℃30 s,55℃45 s,72℃80 s,30 cycles;72℃延伸 5 min.反應結束后,取反應液 1μL,依次加入 2.5μL 2×PCR Buffer,0.5μL dNTPMixture(10 mmol/dm3each),通用正向引物 16 pmol,反向內側引物 16 pmol,0.25 μLTakara ExTaq HS(5 U/μL),加入 RNase free dd H2O補足至終體積為 25μL.在 PCR儀上按照以下程序完成巢式 PCR(nest PCR)反應:94℃預變性2 min,94℃30 s,60℃45 s,72℃80 s,30 cycles;72℃延伸 5 min.反應結束后,取適量反應液用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果.如果電泳圖譜中能檢測到脊髓灰質病毒擴增的特異性條帶,即代表陽性結果,等同于檢測到樣品中脊髓灰質病毒的存在.

在無菌環(huán)境中切下含有脊髓灰質病毒 RT-nest-PCR特異性擴增條帶的瓊脂糖凝膠,按照凝膠回收試劑盒操作說明回收 DNA片斷,16℃與 pMD18-T載體連接過夜;次日,將連接產物轉化至 E.coli HB101感受態(tài)細胞中.取 200μL轉化細菌液涂布在含氨芐青霉素(100μg/mL)的 LB平板上,37℃過夜培養(yǎng);次日挑取單個菌落置于含氨芐青霉素 (100μg/mL)的 LB液中,37℃搖床培養(yǎng)過夜,按照質粒小量純化試劑盒說明書,提取質粒制備脊髓灰質病毒核酸片段質粒標準品.測序工作由上海生物工程有限公司完成,基因核酸序列同源序列分析應用BLAST比對.

2 結 果

2.1 脊髓灰質病毒標準品 RT-nest-PCR檢測方法的建立

以脊髓灰質炎減毒活疫苗提取 RNA,進行一步法 RT-PCR和巢式 PCR反應,瓊脂糖凝膠電泳在500～750 bp間分別檢測到特異條帶,與預期的目的片段大小一致.圖1中:第 1泳道為一步法 RT-PCR后目標片段,核苷酸長度為 671 bp;第 2泳道為巢式PCR后目標片段,核苷酸長度為 575 bp.從瓊脂糖凝膠電泳的檢測結果可看出,經過 RT-nest-PCR方法擴增陽性標準品,擴增條帶清晰特異,表明本次實驗中一步法 RT-PCR和巢式 PCR相結合的方法可用于后續(xù)水樣中脊髓灰質病毒的檢測工作.

圖1 脊髓灰質病毒標準品 RT-nest-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel analysis of RT-nest-PCR products of poliovirus standard

2.2 脊髓灰質病毒特異性核酸片段重組質粒標準品的制備

對已連接入脊髓灰質病毒核酸片段的 pMD18-T重組質粒進行測序,結果獲得一條 575 bp長的核苷酸片段.該序列與國際基因數據庫中已發(fā)表的脊髓灰質病毒的核苷酸序列 (Genbank accession No.DQ890385)進行序列比對,結果發(fā)現(xiàn),其核酸序列與已發(fā)表的脊髓灰質病毒的核苷酸序列完全一致,即相似度為 100%(見圖2).這證明用 RT-nest-PCR方法已經成功地擴增到脊髓灰質病毒的核苷酸片段.同時,制備的包含脊髓灰質病毒核酸片段的質粒標準品,可用于后續(xù)水樣中脊髓灰質病毒檢測時的陽性對照品.

圖2 RT-nest-PCR方法擴增片段序列與已知脊髓灰質病毒核酸序列比對Fig.2 Alignment of nucleic acid sequence of RT-nest-PCR product w ith known poliovirus sequence

2.3 兩種濃縮方法在檢測水樣病毒核酸中的應用

取人工添加脊髓灰質病毒的模擬水樣 500 mL,應用膜吸附法洗脫液提取核酸 RNA后,進行一步法RT-PCR和巢式 PCR反應檢測脊髓灰質病毒.結果顯示,可檢測出病毒核酸 (見圖3).這說明膜吸附法可有效地濃縮分離模擬水樣中的病毒.取 A廠進水口水樣,應用氯化鈉-氯化鋁沉淀法和濾膜吸附法濃縮分離病毒,分別提取核酸 RNA,并分別進行一步法 RT-PCR和巢式 PCR反應檢測脊髓灰質病毒.應用氯化鈉-氯化鋁沉淀法,取水樣 100 mL濃縮分離病毒.應用濾膜吸附法,取 30 mL原水樣稀釋至 500 mL,濃縮分離病毒.瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示 (見圖4),在 2份 RNA待檢樣品中都檢測到脊髓灰質病毒,這表明氯化鈉-氯化鋁沉淀法和濾膜吸附法兩種病毒濃縮方法都能有效地分離濃縮水樣中的病毒.計算能檢測到病毒核酸的水樣的有效體積,氯化鈉-氯化鋁沉淀法為 3.5 mL,濾膜吸附法為2.1 mL.

圖3 模擬水樣中檢測脊髓灰質病毒電泳圖Fig.3 Agarose gel analysis of RT-nest-PCR product of poliov irus in con tam inated water sam p le

2.4 污水處理廠水樣中病毒的檢測

應用氯化鈉-氯化鋁沉淀法濃縮分離 B,C,D廠進水口和出水口水樣中的病毒.進水口水樣取 100 mL,出水口水樣取 1 L.分別提取 6個水樣中的病毒核酸 RNA,進行一步法 RT-PCR和巢式 PCR反應檢測脊髓灰質病毒.瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示 (見圖5),在 3個水廠的進水口和出水口中都檢測到了脊髓灰質病毒的特異性核酸片段.RT-PCR檢測所用有效水樣體積,進水口為 1.17 mL,出水口為 11.70 mL.

圖4 A污水處理廠進水口檢測脊髓灰質病毒電泳圖Fig.4 Agarose gel analysis of RT-nest-PCR products of poliovirus from the influnent water of No.A wast water treatment plant

圖5 B,C,D污水處理廠檢測脊髓灰質病毒電泳圖Fig.5 Agarose gel analysis of RT-nest-PCR products of poliovirus from No.B,C and D wast water treatment plant

3 討 論

本實驗嘗試用兩種濃縮方法對水樣中的病毒顆粒進行富集,結果應用氯化鈉-氯化鋁沉淀法和濾膜吸附法,對某污水處理廠進水口采集實際水樣的檢測中都發(fā)現(xiàn)了脊髓灰質病毒的存在.氯化鈉-氯化鋁沉淀法利用了化學物質的絮凝作用,病毒吸附到預先形成的鋁鹽沉淀物上,從而達到濃縮病毒的作用.其優(yōu)點在于操作方法簡單,材料成本低,不需要特殊的試劑和設備,適于基層實驗室使用[18].研究發(fā)現(xiàn),對于相對潔凈、懸浮物較少的水樣,氯化鈉-氯化鋁沉淀法分離水樣中的病毒,其回收率比起滑石粉-硅藻土濃縮法和陽電濾膜過濾法較高[13].膜吸附-洗脫法是利用病毒的膠體性質和蛋白質的特性,由于濾膜和含有病毒的水體相互獨立,不需要在水相中產生新的固體相吸附病毒,因此,該方法相對于氯化鈉-氯化鋁沉淀法更具可操作性[6].本實驗中的濾膜吸附法由 Haramoto等[15]改進.水樣過膜前,用 A lCl3溶液過膜可增加病毒對膜的吸附;水樣過膜后,用H2SO4(pH=3.0)淋洗濾膜可去除多價陽離子促進洗脫,從而提高病毒回收率;用 NaOH(pH=10.8)溶液代替牛肉浸膏作為洗脫液,可減少后續(xù) cDNA合成和 PCR擴增中的抑制因子,從而增加病毒核酸檢測的靈敏度.

采用本次實驗的方法,在上海市的 3個污水處理廠的進水和出水水樣中都檢測到了脊髓灰質病毒核酸片段.該研究結果與以下研究相似:姬曉琴等[7]的研究結果顯示在西安市石橋污水凈化中心的二級處理水中腸道病毒的陽性檢出率為 87.5%;程莉等在北方某市污水廠的進水和不同工藝水中斗檢測到了輪狀病毒的存在,病毒檢出率為 100%.水體中病毒等病原微生物由于個體小抗性大,在自然環(huán)境中的生存能力比細菌強,常規(guī)水處理技術很難將其徹底消滅去除,因而常規(guī)的大腸桿菌生物檢測指標不能反映水體中病毒污染的情況.值得一提的是,本實驗中所用的 RT-nest-PCR方法具有快速、靈敏、特異性強的特點,尤其對于那些應用細胞培養(yǎng)法難于分離培養(yǎng)的病毒而言更具優(yōu)勢,能夠滿足水體病毒的檢測要求.但是,該方法不能準確反映水樣中所檢測病毒的感染性,因此,在評價水體中病毒污染程度方面仍具有一定的局限性.

[1] 王子健,王東紅.飲用水安全評價 [M].北京:化學工業(yè)出版社,2008:297-306.

[2] 仇付國,王曉昌.水環(huán)境中病毒的分布存活及其健康風險評價[J].西安建筑科技大學學報:自然科學版,2007,39(1):115-118.

[3] FRANCOIS G.World water actions:making water flow for all[C]∥Water Action Unit,Word Water Council.2003:125.

[4] 翁康生,陸曄,劉國星,等.水生生物學技術檢測水中病毒[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2002,12(5):630-632.

[5] 陳小岳,田海林.水體腸道病毒的濃集及核酸檢測方法的應用[J].職業(yè)與健康,2007,23(4):293-295.

[6] 張崇森,劉永軍,王曉昌,等.環(huán)境水體中腸道病毒的膜吸附-洗脫-濃縮方法研究 [J].環(huán)境科學,2008,28(7):1543-1547.

[7] 徐凌云,趙文彬,刁連東,等.環(huán)境水中脊髓灰質炎病毒二年循環(huán)動態(tài)研究 [J].中國流行病學雜志,1996,17(4):236-238.

[8] 鄭耀通,林奇英,謝聯(lián)輝.閩江流域福州過境段水體病毒污染調查分析[J].中國環(huán)境檢測,2004,20(5):39-43.

[9] 邵榮標,周步全,吳巨飛,等.水樣中脊髓灰質病毒檢測方法的實驗研究[J].江蘇預防醫(yī)學,2005,16(3):1-4.

[10] 程莉,何曉青,李偉,等.北方某市城區(qū)水環(huán)境中輪狀病毒的初步檢測[J].生態(tài)毒理學報,2007,2(2):202-207.

[11] 張崇森,劉永軍,王曉昌,等.環(huán)境水體中腸道病毒的膜吸附-洗脫-濃縮方法研究 [J].環(huán)境科學,2008,28(7):1543-1547.

[12] 姬曉琴,張崇森,劉永軍.二級處理出水中腸道病毒的PCR檢測研究 [J].江蘇環(huán)境科技,2008,21(1):68-70.

[13] 趙淑敏,田勇琴,孟昭英,等.三種濃縮方法在水體病毒分離中的比較研究[J].環(huán)境與健康雜志,1996,13(3):120-122.

[14] 郭潤霞,黃海云,冀玲,等.三氯化鋁-氯化鈉絮凝法濃縮水中腸道病毒[J].環(huán)境與健康雜志,1997,14(4):176-176.

[15] HARAMOTO E,KATAYAMA H,OHGAKI S.Detection of noroviruses in tap water in Japan by means of a new method for concentrating enteric viruses in large volumes of fresh water[J]. Applied and Environmental M icrobiology,2004,70(4):2154-2160.

[16] HARAMOTO E,KATAYAMA H,OGUMA K,et al.Application of Cation-coated filter method to detection of noroviruses,enteroviruses,adenoviruses,and Torque Teno viruses in the Tamagawa river in Japan[J].Applied and EnvironmentalM icrobiology,2005,71(5):2403-2411.

[17] 袁長青,葉建鋒,李君文.改進的 PCR技術快速檢測水中腸道病毒的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2000,10(4):395-397.

[18] 吳楚,吳縱斌.水中病毒的檢測方法研究[J].現(xiàn)代農業(yè)科學,2008,15(8):48-50.

(編輯:劉志強)

Application of Two M ethods for Concentrating Viruses and Detection of Polioviruses in Water Samples

YANGMing, SHEN Yang, XU Hai, WANG Kun-peng, WU M ing-hong
(School of Environmental and Chemical Engineering,ShanghaiUniversity,Shanghai200444,China)

X 17

A

1007-2861(2010)05-0465-06

10.3969/j.issn.1007-2861.2010.05.004

2010-07-12

國家自然科學基金資助項目 (40830744,40973073,40973072);上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項基金資助項目(SHU08021);上海大學創(chuàng)新基金資助項目(A10011109006)

吳明紅 (1968～),女,教授,博士生導師,研究方向為污染控制與環(huán)境毒理.E-mail:mhwu@staff.shu.edu.cn