劉微微，任 虹*，曹學(xué)麗，徐春明，王巧娥

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，植物資源研究開發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

天然產(chǎn)物抗氧化活性體外評價方法研究進(jìn)展

劉微微，任 虹*，曹學(xué)麗，徐春明，王巧娥

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，植物資源研究開發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

客觀準(zhǔn)確地評價天然抗氧化劑的抗氧化活性是抗氧化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題，本文對近年來天然產(chǎn)物抗氧化活性體外評價的方法及作用機(jī)制進(jìn)行綜述，介紹目前常用的化學(xué)測定方法和細(xì)胞評價方法的原理及技術(shù)進(jìn)展，并分析兩者的區(qū)別。

抗氧化劑；抗氧化活性；評價方法

Abstract：Antioxidant activity evaluation of natural products has become a hot topic. In this paper, current evaluation methods and antioxidation mechanisms of natural products have been reviewed. The principles and mechanisms of chemical determination and cellular evaluation of antioxidant activity have also been discussed. In addition, the difference is described between both methods.

Key words：antioxidant；chemical methods for evaluating antioxidant activity ；cellular evaluation for evaluating antioxidant activity

自由基是外層軌道含有未配對電子的基團(tuán)，其化學(xué)性質(zhì)活潑，且種類多，可攻擊細(xì)胞內(nèi)包括 DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、有機(jī)酸等幾乎所有生物分子，破壞性極強(qiáng)[1]。醫(yī)學(xué)研究表明，各種自由基所引發(fā)的氧化作用是導(dǎo)致身體中各組織器官損傷、病變的重要原因之一，人類許多重大疾病如動脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、癌癥以及衰老過程均與自由基造成的氧化損傷有關(guān)。因此，抗氧化活性物質(zhì)的研究與開發(fā)成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[2-4]。化學(xué)合成抗氧化劑如二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)、沒食子酸丙醋(PG)和特丁基對苯二酚(TBHQ)曾一度受到青睞，但通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它們有一定毒性和致畸作用，使得人們對合成抗氧化劑產(chǎn)生了疑慮。天然抗氧化劑安全、無毒，符合人們對健康、安全的新需求。大量臨床研究表明，多種天然植物包括蔬菜、水果、谷物及中草藥等都含有黃酮、多酚、鞣質(zhì)、皂苷及生物堿等抗氧化活性成分，在一定程度上減少了機(jī)體的氧化損傷[5-6]。因此從資源豐富的天然植物中活性跟蹤尋找高效、低毒、價廉的抗氧化劑成為該領(lǐng)域研究的一個重要方向，其中抗氧化活性評價方法對天然抗氧化劑的研究開發(fā)至關(guān)重要。目前研究評價抗氧化活性的方法主要有化學(xué)測定方法和細(xì)胞抗氧化評價方法，本文綜述了這兩類抗氧化活性測定方法的作用機(jī)制及其技術(shù)進(jìn)展，并對它們進(jìn)行了對比，以期為抗氧化性活性評價體系的建立提供參考。

1 抗氧化活性的化學(xué)測定方法

抗氧化的化學(xué)測定方法主要在化學(xué)反應(yīng)容器中采用自氧化反應(yīng)方法，測定抗氧化劑針對某一種或某一類自由基的清除或抑制作用，作用機(jī)制主要有以下幾點(diǎn)：1)抗脂質(zhì)過氧化；2)清除或抑制自由基；3)影響抗氧化酶的生物活性；4)減少DNA的氧化損傷。

1.1 以脂質(zhì)過氧化為基礎(chǔ)的測定方法

在生物體內(nèi)，癌癥的發(fā)生及老化都與體內(nèi)脂肪的氧化有關(guān)，脂質(zhì)過氧化是一個十分復(fù)雜的過程，受許多因素干擾，在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)早期，多不飽和脂肪酸碳鏈上可形成共軛雙鍵，可直接采用紫外分光光度法定量測定[7]，后期脂質(zhì)最終氧化成醛、酮[8]。目前，脂質(zhì)氧化多用化學(xué)、物理或感官的方法檢測，化學(xué)方法包括：過氧化值(peroxide value，PV) 法、共軛二烯過氧化物法、硫氰酸鐵法(ferric thioeyanate method，F(xiàn)TC)、硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid，TBA)、2,4-二硝基苯肼法、克雷斯實(shí)驗(yàn)法(Kreis test)和茴香胺值(anisidine value)等，見表1。

李均等[9]對中華補(bǔ)血草根提取物對大豆卵磷脂脂質(zhì)體體系中所產(chǎn)生的共軛二烯過氧化物和丙二醛的抑制率進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取物作用96h后對共軛二烯過氧化物和丙二醛的抑制率分別為79.03%和93.36%，比陽性對照槲皮素(對二者抑制率分別為84.67%和96.54%)略低，顯示中華補(bǔ)血草根提取物具有較明顯的抗氧化活性。硫氰酸鐵鹽(FTC)比色法基于酸性條件下脂質(zhì)過氧化物可將Fe2+氧化成Fe3+，F(xiàn)e3+與硫氰酸根離子形成紅色絡(luò)合物，在波長480～515nm處有最大吸收，吸光度越小表明物質(zhì)的抗脂質(zhì)過氧化能力越強(qiáng)。Rowena等[10]采用FTC法對5種菲律賓甘薯Dakol、Emelda、Violet、PSBSP和Haponita的抗氧化活性進(jìn)行了測定，甲醇提取浸膏質(zhì)量濃度為10mg/mL時，Haponita的抗氧化活性最強(qiáng)，抑制率為(99.4±0.9)%，Violet最弱，抑制率為(87.4±1.0)%，而且Violet的抗氧化活性與Dakol、Emelda、PSBSP的差異不顯著(P＞0.05)。Hanachi等[11]采用TBA法考察中草藥Berberis vulgaris的抗氧化活性，并以BHT和VE為參照，發(fā)現(xiàn)在相同質(zhì)量濃度(0.2mg/mL)條件下，乙醇提取物活性最強(qiáng)，抑制率達(dá)(27.26±1.07)%，其次是BHT抑制率為(20.29±0.23)%、甲醇提取物為(16.80±0.23)%、VE為(6.68±0.25)%，水提取物活性最低，抑制率為(6.53±0.29)%。

1.2 以清除自由基為基礎(chǔ)的測定方法

體內(nèi)自由基過剩，會對機(jī)體產(chǎn)生損傷。通過測定抗氧化劑清除自由基的能力來評價抗氧化活性，常用的方法有DPPH法、DMPD法、ORAC法等，見表2。

DPPH法[12]基于二苯代苦味?；?DPPH)自由基在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性及其在波長517nm處的強(qiáng)吸收，抗氧化劑存在時，與其孤對電子配對而使光吸收消失或減弱，從而測得抗氧化劑對DPPH自由基的清除效果。因其快速、簡便、靈敏，該法成為評價天然抗氧化劑的最常用方法之一。Si等[13]從大青楊樹葉中分離得到兩個新的酚苷類化合物異大齒楊苷A(1)和B(2)、5個已知的酚苷類化合物大齒楊苷(3)、柳匍匐苷(4)、楊屬靈(5)、楊屬靈A(6)、柳皮苷(7)以及2個已知的酚酸類化合物P-香豆酸(8)和咖啡酸(9)。采用DPPH自由基清除法和TEAC法測定它們的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)化合物1～6和9具有較強(qiáng)的抗氧化活性，IC50值分別為6.68、6.61、6.75、6.84、6.76、6.79mmol/L和5.92mmol/L；TEAC值分別為1.21、1.28、1.26、1.05、1.69、1.60mmol/L和2.00mmol/L。

DMPD(二甲基對苯二胺)法由 Fogliano等[14]提出，在酸性條件下，DMPD被氧化生成穩(wěn)定的DMPD+·，它在波長505nm處有最大吸收峰，根據(jù)加入抗氧化劑后吸光度的變化可測得樣品清除自由基的能力。Gil等[15]采用DMPD法和DPPH法測定比較石榴汁、紅葡萄酒、綠茶飲料的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)這兩種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，都顯示出石榴汁的抗氧化活性(18～2TEAC)強(qiáng)于紅葡萄酒和綠茶飲料的活性(6～8TEAC)。

表1 脂質(zhì)過氧化評價方法Table 1 Evaluation methods for lipid peroxidation

表2 自由基清除能力評價方法Table 2 Evaluation methods for scavenging capacity to free radicals

氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法[16-17]采用β-藻紅蛋白(βphycoerythrin，β-PE)為熒光指示蛋白，以偶氮化合物2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽[2,2’-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride，AAPH]、Cu2+-H2O2體系作為脂過氧化自由基或羥自由基的來源，以VE 類似物Trolox為參照。β-PE受到自由基攻擊時，在一定的波長下熒光度不斷衰減，根據(jù)其熒光強(qiáng)度衰減曲線變化計(jì)算出樣品的自由基清除能力。Wang等[18]利用ORAC法對12種水果和5種果汁進(jìn)行了抗氧化活性測定，其中草莓的ORAC值最高，其次為李子和橘子，而果汁中葡萄汁的ORAC值最高，其次為柚汁和番茄汁。

總自由基清除抗氧化能力(total peroxyl radical-trapping antioxidant parameter，TRAP) 法是由 Wayner 等[19]1985年提出，該法采用2,2-偶氮(2-脒基丙烷)(ABAP)作為過氧化物自由基的引發(fā)劑，以氧濃度的降低作為評價氧化的速率。Boumerfeg等[20]采用TRAP法研究漿果薯蕷的甲醇、乙酸乙酯、正丁醇萃取物的抗氧化活性，結(jié)果表明TRAP法得到的抗氧化活性順序與酶法(細(xì)胞色素C還原法)得到的順序基本一致，乙酸乙酯提取物的抗氧化活性＞氯仿提取物＞甲醇提取物。

Winston等[21]建立的總氧自由基清除能力(total oxyradical scavenging capacity，TOSC)法克服了機(jī)體某種特定抗氧化成分難以準(zhǔn)確反映生物體實(shí)際抗氧化應(yīng)激能力的局限性，TOSC法以氣相色譜或液相色譜為檢測手段檢測機(jī)體的總氧自由基清除能力，其優(yōu)勢是能較全面地反映機(jī)體的總抗氧化能力，是目前測定總氧自由基的常用方法。Kwondo等[22]采用TOSC法研究9種日常飲料的抗氧化活性，并以抗壞血酸作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9種飲料的抗氧化能力依次為：抗壞血酸＞烏龍茶＞紅茶＞茉莉花茶＞葡萄汁＞可可＞綠茶＞速溶咖啡＞李子汁＞咖啡，其中咖啡的抗氧化能力僅為抗壞血酸的1/7。

Benziei等[23-24]等建立鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP) 法，利用抗氧化劑將三吡啶三嗪三價鐵[TPTZ-Fe3+]還原為藍(lán)色的三吡啶三嗪二價鐵[TPTZ-Fe2+]，反應(yīng)結(jié)果常以Fe2+當(dāng)量表示。FRAP法簡便、快捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好。Luximon等[25]采用FRAP和TEAC法研究了不同時期收獲的肉桂管的營養(yǎng)器官和生殖器官的抗氧化活性，結(jié)果表明生殖器官的抗氧化活性較強(qiáng)，其中豆莢的抗氧化活性最強(qiáng)，TEAC值為(992±0.4)μmol/L；FRAP值為(811±23)μmol/L。

Valkonen 等[26]還報(bào)道二氯熒光素二乙酸酯(dichorofluorescin - diacetane，DCFH-DA)法也是測定總的自由基清除能力。AAPH產(chǎn)生的過氧自由基氧化DCF H-DA生成二氯熒光黃(dichlorofluorescein，DCF)，DCF有強(qiáng)熒光(激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長526nm)，在波長504nm處也有吸收，因此可用熒光法或分光光度法檢測。

1.3 測定抗氧化劑對抗氧化酶活性的影響

機(jī)體內(nèi)清除自由基的酶系統(tǒng)主要有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等酶類組成，都是鐵卟啉蛋白酶，催化體內(nèi)氧化酶的毒性產(chǎn)物H2O2分解。在正常情況下，機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基被細(xì)胞的SOD歧化為H2O2，后者再由細(xì)胞漿的CAT和GSH-Px催化降解為水和氧。

李興泰等[27]考察連翹醇提物的抗氧化活性，測定連翹醇提物對6周齡雌性小鼠血液中SOD、CAT和GSHPx酶活性的影響，以VE為陽性對照，發(fā)現(xiàn)當(dāng)醇提物含量為0.4g/kg時，SOD、CAT和GSH-Px酶活力分別為(202.0±27)、(10.1±1.8)U/mg 蛋白和(44.8±9.5)U/mg 蛋白；當(dāng)醇提物含量為0.8g/kg時，三者酶活力分別升高至(225±26)、(12.7±2.4)U/mg 蛋白和(47.6±5.8)U/mg 蛋白，隨醇提物含量遞增酶活增加。Jodynis-Liebert等[28]研究了耬斗花的乙醇和乙酸乙酯提取物及異金雀兒黃素對撲熱息痛介導(dǎo)的大鼠的氧化應(yīng)激的影響，發(fā)現(xiàn)它們可以升高由撲熱息痛引起的各種抗氧化酶活性的降低，CAT升高50%，GSH-Px升高50%，谷胱甘肽還原酶升高50%，谷胱甘肽S2轉(zhuǎn)移酶升高60%，還減少肝中18%～48%的脂質(zhì)過氧化。

1.4 DNA氧化損傷的測定

DNA是機(jī)體中攜帶遺傳信息的重要物質(zhì)，也是最易受到氧自由基攻擊的生物大分子之一。正常情況下，機(jī)體可通過自身修復(fù)機(jī)制及時修補(bǔ)受損的DNA分子，維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。但當(dāng)發(fā)揮抗氧化作用的防御體系不健全時，機(jī)體細(xì)胞的自身修復(fù)系統(tǒng)不能及時地對損傷加以修復(fù)，最終導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。DNA被氧化時，鳥苷酸上C-8是最易發(fā)生損傷的位點(diǎn)，由此形成的8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是評價DNA氧化損傷的最常用指標(biāo)。彗星實(shí)驗(yàn)是公認(rèn)的DNA損傷檢測方法，通過檢測DNA鏈斷裂反映損傷情況。Braz等[29]對麻醉劑丙泊酚是否會對手術(shù)病人產(chǎn)生DNA損傷及脂質(zhì)過氧化進(jìn)行了研究，選擇進(jìn)行了90min手術(shù)的病人為實(shí)驗(yàn)者，丙泊酚濃度控制在2～4μg/mL之間，分別收集初期、麻醉誘導(dǎo)后、手術(shù)末期和術(shù)后第1天的靜脈血，采用彗星實(shí)驗(yàn)測定白細(xì)胞DNA的損傷。彗星實(shí)驗(yàn)及血漿動力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明4次取樣測定結(jié)果未有大區(qū)別，未發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞中DNA損傷，血漿中丙二醛含量也未發(fā)生變化，表明丙泊酚不會誘導(dǎo)DNA損傷及脂質(zhì)過氧化。

上述化學(xué)測定方法均是在一定的反應(yīng)容器內(nèi)通過自氧化方法測定天然產(chǎn)物的抗氧化活性，因具有簡單、快捷、處理量大等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。這些方法對檢測生物制品、植物提取物以及單體化合物的體外抗氧化能力提供了重要的信息，并在研究氧化與疾病關(guān)系方面發(fā)揮著重要的作用。但隨著研究的不斷深入，抗氧化活性化學(xué)測定方法的局限性逐漸顯現(xiàn)，Wolfe等[30]采用ORAC、TEAC及FRAP三種方法對槲皮素、山奈酚、楊梅素、兒茶素、咖啡酸、沒食子酸、表兒茶素、表兒茶素酸酯共8個單體化合物的抗氧化活性進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ORAC法中活性最強(qiáng)的3個為槲皮素、兒茶素和咖啡酸，在TEAC法中為沒食子酸、表兒茶素和表兒茶素酸酯，而咖啡酸活性很弱；在FRAP法中，最強(qiáng)的3個依次為槲皮素、楊梅素和山奈酚，而沒食子酸活性不強(qiáng)。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果研究表明，沒有一種化學(xué)檢測方法可以全面、準(zhǔn)確地評價待測物的抗氧化活性。

2 抗氧化活性的細(xì)胞評價方法

每種化學(xué)方法不可能全面評價抗氧化活性的原因主要在于[31-32]：1)抗氧化活性的化學(xué)測定方法無法真實(shí)模擬生理環(huán)境，沒有考慮藥物跨膜進(jìn)入細(xì)胞、藥物吸收及其與載體或酶等生物大分子之間的相互作用。2)體內(nèi)新陳代謝作用大大增加了活性物質(zhì)抗氧化能力的不確定性，未考慮代謝毒性及生物有效利用性，許多情況下，有活性的化合物可能不是原本的化合物而是其代謝產(chǎn)物。3)生物體抗氧化反應(yīng)途徑多樣復(fù)雜，各體系間相互作用，通常用不同方法測得的抗氧化活性的數(shù)據(jù)相關(guān)性很差，因?yàn)椴煌椒ǖ膫?cè)重點(diǎn)不同，如ORAC法、TRAP法和TOSC法測定的是抗氧化抑制體系中活性自由基引起的氧化還原反應(yīng)的能力，而FRAP法測定的是被測物的還原能力。4)抗氧化劑與生物體液一般是混合的，其中每一種物質(zhì)對不同測量方法的貢獻(xiàn)不同；通常，對于天然抗氧化劑，以抑制底物氧化降解的方法用的較多；對于生物試樣，則多用測定其清除自由基能力的方法。5) 測定的樣品大多為植物提取物，成分復(fù)雜，其抗氧化作用無法用單一的機(jī)制解釋。天然抗氧化劑往往具有多功能性，當(dāng)用以一種抗氧化作用機(jī)理為主的方法進(jìn)行測定時，就決定其測定體系氧化條件，而不同氧化條件又影響氧化反應(yīng)動力學(xué)和體系組成，這些相關(guān)參數(shù)的影響不可能用一種單機(jī)理測定方法來評價。同時，抗氧化活性還受很多因素如在水相和有機(jī)相間分配效應(yīng)、氧化條件和環(huán)境以及氧化底物物理狀態(tài)等的影響。動物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有直接說明意義，但此方法昂貴耗時，不適宜初期篩選。因此為了尋找適合人體生理環(huán)境的、高效低毒的天然抗氧化劑，人們提出以細(xì)胞為載體評價抗氧化劑對細(xì)胞的抗氧化活性。

以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的活性篩選模型是用來研究藥物分配進(jìn)入細(xì)胞膜、藥物吸收及與載體或酶等生物大分子相互作用的有效方法，目前，Liu等[33]和Wolfe等[34-35]提出了抗氧化活性的細(xì)胞篩選方法(cellular antioxidant activity assay，CAA)，以結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、肝癌細(xì)胞HepG2及乳房癌細(xì)胞MCF-7為靶細(xì)胞，以2＇,7＇-二氯熒光黃二乙酯(DCFH-DA)為熒光探針，在細(xì)胞水平上檢測抗氧化劑對自由基氧化作用的抑制效果，初步篩選了25種水果的70%甲醇粗提物抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓、石榴、草莓、蔓越桔、李子、櫻桃、蘋果、紅葡萄活性較強(qiáng)，EC50值分別為2.53、2.95、5.46、15.6、22.9、27.3、34.4mg/mL和45.3mg/mL，并檢測了其中黃酮類化合物的活性，發(fā)現(xiàn)B環(huán)3',4'-羥基取代的黃酮醇類如槲皮素、山奈酚、表兒茶素酸酯、木犀草素、桑黃素和楊梅素等的活性較強(qiáng)，EC50值分別為8.9、11.9、14.2、23.8、27.6μmol/L和31.1μmol/L，而異黃酮類不呈現(xiàn)活性。與傳統(tǒng)的“試管”化學(xué)測定方法相比，在開發(fā)抗氧化藥物方面，CAA評價方法更具可靠性和說服力，日益被人們認(rèn)可，對日后抗氧化劑的研究開發(fā)將產(chǎn)生更大價值。

3 結(jié) 論

抗氧化活性測定的根本標(biāo)準(zhǔn)和目的是客觀、準(zhǔn)確地評價抗氧化劑的抗氧化效果，既要測定待測物的含量、化學(xué)成分及其抗氧化能力，同時還要考慮抗氧化評價方法的靈敏性和穩(wěn)定性。目前抗氧化活性評價方法很多，各有特色，各有優(yōu)勢和局限性，不可能用一種方法全面準(zhǔn)確地反映某一抗氧化劑的抗氧化活性，所以有必要在大量實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，基于不同用途，建立起一系列完整的抗氧化活性的評價體系和方法，以便客觀、準(zhǔn)確地評價抗氧化效果，并確保結(jié)果的可靠性與重現(xiàn)性，從而高效率研究開發(fā)活性高、毒副作用低、特異性強(qiáng)的天然抗氧化劑。

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Progress in Evaluation Techniques for Antioxidant Activity of Natural Productsin vitro

LIU Wei-wei，REN Hong*，CAO Xue-li，XU Chun-ming，WANG Qiao-e
(Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, College of Chemical and Environmental Engineering,Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)17-0415-05

2009-12-09

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA092400)

劉微微(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锟寡趸渭壌x物研究。E-mail：liuweiwei731@163.com

*通信作者：任虹(1967—)，女，副研究員，博士，研究方向?yàn)樘烊换钚援a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：renhong@th.btbu.edu.cn