李黃金，陳 偉，趙 林，柴偉佳，唐 偉

(廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體的構(gòu)建

李黃金，陳 偉，趙 林，柴偉佳，唐 偉

(廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

為構(gòu)建一種食品殘留檢測用二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體(sdsFvCAP)。以抗氯霉素抗體可變區(qū)基因為模板，通過引物突變PCR在輕鏈和重鏈的可變區(qū)分別引入一個半胱氨酸定點突變，以重疊延伸PCR組裝成sdsFvCAP。在大腸桿菌系統(tǒng)強(qiáng)啟動子T7驅(qū)動下，sdsFvCAP基因不能單獨表達(dá)，而通過同義突變降低其5＇端序列GC含量則可實現(xiàn)高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，經(jīng)β-環(huán)糊精分子伴侶系統(tǒng)復(fù)性可獲得親和力與母本抗體相似的sdsFvCAP。所構(gòu)建的sdsFvCAP具有取代單克隆抗體用于氯霉素殘留檢測的潛力。

氯霉素；二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體；高效表達(dá)；β-環(huán)糊精分子伴侶；復(fù)性

Abstract：To construct a disulfide-stablized single chain variable fragment directed against chloramphenicol (sdsFvCAP), both cloned V genes were introduced a cystine code by site-specific mutagenesis, then assembled into sdsFvCAP gene by overlap extension PCR. Under the control of strong promoter T7, the sdsFvCAP gene was failed to be individually expressed inEscherichia coli, but over-expressed as inclusion when GC content in the terminal 5 sequence was decreased by synonymous mutation. The inclusion protein was refolded withβ-cyclodextrin companion system, and showed affinity similar to its parent monoclonal antibody(MAb). The sdsFvCAP prepared in this study could be potentially used instead of conventional antisera or MAb for development of a rapid and affordable immunoassay for the detection of residual CAP in foods.

Key words：chloramphenicol；disulfide-stablized single chain variable fragment；over-expression；β-cyclodextrin companion；renaturation

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一種可引起人類再生障礙性貧血粒狀白細(xì)胞缺乏癥等嚴(yán)重疾病的抗生素，自1994年起便被聯(lián)合國禁止使用，我國亦自2002年起明確規(guī)定動物源性食品中氯霉素殘留不得檢出[1]，但由于廉價高效，目前仍被廣泛非法濫用于養(yǎng)殖業(yè)，給人民生命健康和我國動物源性食品相關(guān)產(chǎn)品的出口貿(mào)易帶來了較大的挑戰(zhàn)。特異性抗體在食品有害殘留檢測中具有重要意義，高質(zhì)量的抗體是食品有害殘留樣品的制備和檢測的關(guān)鍵試劑[2]。單克隆抗體(MAb)具有特異性強(qiáng)和親和力高的優(yōu)點，但其現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)存在生產(chǎn)成本高、規(guī)模難于工業(yè)放大和質(zhì)控等缺點。基因工程小分子抗體是單克隆抗體的理想替代產(chǎn)品，目前已有眾多獸藥和農(nóng)藥類小分子半抗原的基因工程抗體的報道[3-5]。單鏈抗體(scFv)是一種以柔性接頭連接抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的小分子基因工程抗體，該類抗體既保留了母本抗體的親和力又便于基因工程手段生產(chǎn)，故得到了較廣泛的研究和應(yīng)用。但該類抗體的兩個可變區(qū)之間由于缺乏母本抗體那樣的鏈間二硫鍵，因此穩(wěn)定性較差。二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體(sdsFv)即是通過模擬天然抗體的結(jié)構(gòu)而在單鏈抗體基礎(chǔ)上引入一對二硫鍵的構(gòu)建形式[6]。本實驗組曾報道了抗氯霉素單克隆抗體可變區(qū)基因的克隆[7]，本實驗在此基礎(chǔ)上研究一種二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體(sdsFvCAP)的構(gòu)建，為進(jìn)一步研制基于基因工程抗體技術(shù)的氯霉素殘留檢測試劑提供參考，同時對其他種類和用途的sdsFv的構(gòu)建與生產(chǎn)具有重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

抗CAP Mab粗制品、含抗CAP的VH(FJ477893)和VL(FJ477894)基因的質(zhì)粒pMD18-T-VH與 pMD18-T-VL、氯霉素-卵清蛋白偶聯(lián)物(CAP-OVA)、大腸桿菌DH5α 本實驗制備或保存。大腸桿菌BL21(DE3)、表達(dá)載體pET21a和pET32a Novagen公司；pMD18-T、Taq酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA lader、TaKaRa MutanBEST Kit 大連寶生物工程有限公司；DNA回收試劑盒 百泰克生物技術(shù)有限公司；HisTrap FF柱(1mL)、HiTrap Protein G柱(1mL)、HRP-anti-His6 tag、HRP-goat-anti-mouse IgG、Sephadex G25 GE公司；BCA試劑盒 廣州美津生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

V基因定點突變用引物：VH-m1：5＇-TTCAGGGA＇(下劃線處為 Cys 密碼子)；VH-m2：5＇-GACTGACGAATCCAGCCTACACT-3＇；VL-m1：＇；VL-m2：5＇-GTCGGAGGAACATGTGAACCTT-3＇。sdsFvCAP組裝用引物：A(VH5＇)：CAGCTGAAGGAGTC-3＇(下劃線處為NdeⅠ識別位點)；B(VH3＇-linker)：5＇-GCCACCACCGCCGCTACC ACCGCCGCCGCTACCGCCACCACCGGCTGAGGAG-3＇；C(linker-VL5＇)：5＇-GTGGCGGTAGCGGCGGCG GTGGTAGCGGCGGTGGTGGCAGCGATGTTTTGATGAC-3＇；D(VL3＇)：5TGATGATGATGAGCCCGTTTGATTTCCAGCT-3＇(下劃線處為HindⅢ識別位點，序列中引入了His6標(biāo)簽的編碼序列)；E：5CTGAAGGAGTC-3＇(下劃線處為NcoⅠ識別位點)。所有引物均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 V基因定點突變

采用TaKaRa MutanBEST Kit按廠家說明進(jìn)行。VH突變模板為pMD18-T-VH，引物為VH-m1和VH-m2；VL突變模板為pMD18-T-VL，引物為VL-m1和VL-m2。

1.4 sdsFvCAP基因組裝與克隆

以上述突變VH和VLPCR產(chǎn)物為模板，以引物A與B擴(kuò)增VH-linker，以引物C與D擴(kuò)增linker-VL。PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共25個循環(huán)；72℃ 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1g/100mL瓊脂糖凝膠電泳分離后用DNA回收試劑盒按照廠家說明書進(jìn)行目的片段回收。回收片段經(jīng)適當(dāng)稀釋后進(jìn)行下述二步擴(kuò)增反應(yīng)：第一步，VH-linker和linker-VL進(jìn)行重疊延伸，反應(yīng)條件為94℃ 5min；94℃ 1min，72℃ 1.5min，共5個循環(huán)；第二步，以引物A和D或E和D配對進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃ 5min，94℃ 30s，60℃30s，72℃ 1.5min，共25個循環(huán)，72℃ 7min。A～D引物對擴(kuò)增產(chǎn)物以NdeⅠ和HindⅢ雙酶切后按常規(guī)方法[8]克隆于表達(dá)載體pET21a的相同位點，得表達(dá)載體pET21asdsFvCAP；E～D引物對擴(kuò)增產(chǎn)物以NcoⅠ和HindⅢ雙酶切后克隆于pET32a的相同位點，得融合表達(dá)載體pET32a-sdsFvCAP。所有表達(dá)載體的構(gòu)建均以大腸桿菌DH5α為宿主菌，所獲表達(dá)載體委托深圳華大基因有限公司進(jìn)行目的基因表達(dá)盒序列分析。經(jīng)序列分析確證后的表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)，得sdsFvCAP工程菌。

1.5 sdsFvCAP基因表達(dá)誘導(dǎo)

sdsFvCAP工程菌接種于含50μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，按體積分?jǐn)?shù)1%轉(zhuǎn)接新鮮LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2.5h，加入IPTG至終濃度1mmol/L進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)，共誘導(dǎo)4h，6000r/min離心5min收集菌體。

1.6 sdsFvCAP包涵體蛋白分離純化

經(jīng)表達(dá)誘導(dǎo)所獲菌體按10 g/100 mL懸浮于含500mmol/L NaCl的20mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.5)，于冰浴中以300W輸出功率間歇式超聲破碎10min，12000r/min離心10min。所獲沉淀分別用含體積分?jǐn)?shù)2% Triton X100、500mmol/L NaCl和不同濃度尿素的20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)洗滌，最后所獲離心沉淀按濕質(zhì)量的1g/100mL懸浮于變性緩沖液(含8mol/L尿素、1%β-巰基乙醇和500mmol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.0)，37℃水浴3h，12000r/min離心10min，所獲上清以HisTrap FF柱參照廠家說明進(jìn)一步純化，其中平衡緩沖液為含20mmol/L咪唑的變性緩沖液，洗脫緩沖液為含300mmol/L咪唑的變性緩沖液。

1.7 sdsFvCAP包涵體蛋白的復(fù)性

變性的目的蛋白參照β-環(huán)糊精人工伴侶系統(tǒng)[9]以含18mmol/Lβ-環(huán)糊精的20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)進(jìn)行稀釋復(fù)性，稀釋后的蛋白質(zhì)溶液中SDS的終濃度控制為2mmol/L，β-環(huán)糊精的終濃度為8mmol/L。稀釋液在室溫下磁力攪拌過夜。以0.45μm纖維素膜過濾法去除可見沉淀，以Sephadex G25柱按30%上樣體積將上述復(fù)性產(chǎn)物的緩沖液置換為20mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.5)。

1.8 蛋白質(zhì)SDS-PAGE與凝膠掃描分析

參照常規(guī)方法進(jìn)行各種樣品的SDS-PAGE。菌體培養(yǎng)物或純化過程中的蛋白樣品以兩倍上樣緩沖液煮沸5min，還原電泳上樣緩沖液不含β-巰基乙醇。電泳所獲凝膠以“天能牌”凝膠密度掃描儀按廠家說明進(jìn)行拍照和表達(dá)水平或蛋白質(zhì)純度分析。

1.9 蛋白質(zhì)濃度測定

采用BCA試劑盒參照廠家說明進(jìn)行，以小牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.10 抗體親和力常數(shù)測定

參照Batty等[10]非競爭性ELISA法進(jìn)行，以sdsFvCAP樣品和母本單抗4D10平行分析，酶標(biāo)二抗分別為HRP-anti-His6tag和HRP-goat-anti-mouse IgG。為使母本單抗與待測sdsFvCAP樣品純度基本一致，將抗CAP Mab粗制品(經(jīng)辛酸硫酸銨法制備)以HiTrap Protein G柱按照廠家說明書進(jìn)行純化，其中柱平衡緩沖液為20mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.4)，洗脫緩沖液為100mmol/L的甘氨酸-HCl(pH2.7)，目的峰樣收集于預(yù)置中和緩沖液1mol/L Tris-HCl(pH9.0)。親和力常數(shù)測定時以1、2μg/mL和4μg/mL 3個不同質(zhì)量濃度的CAP-OVA(抗原)包被酶標(biāo)板，供試抗體經(jīng)濃度測定后倍比稀釋。以抗體的濃度(mol/L)為橫坐標(biāo)、以O(shè)D450nm值為縱坐標(biāo)作圖，找出其ODmax值，并求出OD450nm=1/2ODmax時相對應(yīng)的抗體濃度[Ab]＇1/2，按公式Ka=(n－ 1)/[2(n[Ab]＇1/2－[Ab]1/2)]分別求出兩種抗原濃度之間的Ka值，其中n為抗原高低濃度之比，[Ab]＇1/2為較低濃度抗原對應(yīng)的[Ab]1/2。所得3個Ka值的算術(shù)平均值即為抗體的親和常數(shù)，單位為濃度的倒數(shù)，即L/mol。

2 結(jié)果與分析

2.1 V基因突變與組裝

通過定點突變技術(shù)在抗氯霉素抗體VH和VL基因中引入半胱氨酸密碼子，突變V基因經(jīng)測序確證后采用重疊延伸PCR法組裝成VH-linker-VL型sdsFvCAP，其中的linker序列為(Gly4Ser)3。突變的氨基酸殘基位點如圖1所示，VH的突變位點為第2框架區(qū)的第49位氨基酸，與Kabat數(shù)據(jù)庫VH的保守序列第44位氨基酸殘基相對應(yīng)；VL的突變位點為第4框架區(qū)的第120位氨基酸，與VL的保守序列第100位氨基酸殘基相對應(yīng)[11]。

圖1 抗氯霉素抗體V區(qū)半胱氨酸突變位點Fig.1 Cysteine site introduced in V region of antibody against chloramphenicol

sdsFvCAP基因組裝結(jié)果如圖2所示，經(jīng)重疊延伸PCR所得sdsFvCAP基因片段與理論大小一致，大小約為790bp，經(jīng)序列分析與設(shè)計序列一致，定名為sdsFvCAP-1(GenBank：GU258050)。

圖2 重疊延伸PCR組裝sdsFvCAP-1Fig.2 Overlap extension PCR for sdsFvCAP-1

2.2 sdsFvCAP-1基因克隆與表達(dá)

上述s d s FvCAP-1基因組裝產(chǎn)物克隆于表達(dá)載體pET21a和pET32a，以便在宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行獨立表達(dá)或融合表達(dá)。表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，在強(qiáng)啟動子T7驅(qū)動下，sdsFvCAP-1基因不能有效單獨表達(dá)，但當(dāng)其5＇端融合于硫氧環(huán)蛋白(Trx)基因之后時即可高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大小約為45kD，與理論值一致。

圖3 sdsFvCAP-1基因在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)Fig.3 Expression of sdsFvCAP-1gene inEscherichia coliBL21(DE3)

圖4 sdsFvCAP-2基因在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)Fig.4 Expression of sdsFvCAP-2gene inEscherichia coliBL21(DE3)

通過PCR引物對sdsFvCAP-1基因5＇端進(jìn)行同義突變，以便優(yōu)化目的基因。將30bp序列內(nèi)所有密碼子中的第3位堿基G或C全部置換成A或T，得到同義突變型基因sdsFvCAP-2(GenBank：GU258050)。所獲sdsFvCAP-2基因5＇端30bp序列內(nèi)的GC含量由60%降至36%，克隆于表達(dá)載體pET21a后獨立表達(dá)時即可高效表達(dá)(圖4)，表達(dá)產(chǎn)物大小約為28kD，與理論值一致，表達(dá)水平與融合表達(dá)相似，達(dá)到30%以上。

2.3 sdsFvCAP-2基因表達(dá)產(chǎn)物分離純化與分析

圖5 sdsFvCAP-2基因表達(dá)產(chǎn)物分離純化Fig.5 Purification of product of scFvCAP-2gene expressed inEscherichia coliBL21(DE3)

如圖5所示，sdsFvCAP-2基因表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體蛋白存在，因為目的大小的蛋白主要出現(xiàn)在菌體超聲破碎沉淀中。包涵體經(jīng)含2mol/L尿素的緩沖溶液簡單洗滌后純度達(dá)到90%以上，但所獲包涵體蛋白經(jīng)變性后以HisTrap預(yù)裝柱進(jìn)行基于His標(biāo)簽的親和層析純化并未見純度顯著提高(結(jié)果未給出)。包涵體蛋白可完全被8mol/L尿素溶液裂解，變性蛋白采用常規(guī)的稀釋復(fù)性法復(fù)性時絕大部分目的蛋白被聚沉(結(jié)果未給出)，但采用β-環(huán)糊精分子伴侶系統(tǒng)復(fù)性未見顯著沉淀。所獲復(fù)性溶液與純度相近(90%)的母本抗體所進(jìn)行的平行分析結(jié)果表明，sdsFvCAP對氯霉素的親和力與母本抗體4D10的相似，二者的親和力常數(shù)分別為7.0×10-9L/mol和4.5×10-9L/mol。

3 討 論

單鏈抗體(scFv)是目前得到廣泛應(yīng)用的基因工程抗體類型，該類抗體是以(Gly4Ser)3肽將VH和VL片段連接起來而形成的單鏈小分子抗體。眾多的研究結(jié)果表明，scFv類小分子抗體擁有與母本單抗相似、甚至更高的親和力[12-13]。二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體(sdsFv)是為了提高scFv的穩(wěn)定而在VH和VL間引入一對二硫鍵的改良型。目前在sdsFv中的二硫鍵位置主要是VH44和VL100，分別位于VH的FR2區(qū)和VL的FR4，均不是抗原識別位點，所以此處引入二硫鍵對抗體的親和力影響不大[14]。通過以KABAT數(shù)據(jù)庫比對單抗V區(qū)氨基酸保守序列進(jìn)行推斷，得出先前克隆的抗氯霉素抗體V基因的突變位點為VH49和VL120，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建sdsFvCAP。

與scFv類抗體一樣，sdsFv也有VH-linker-VL和VL-linker-VH兩種構(gòu)建形式。有研究表明，以前種形式構(gòu)建的sdsFv親和力高于后者形式的，但表達(dá)水平遠(yuǎn)低于后者的[15]。在本研究中所構(gòu)建的sdsFvCAP-1基因不能獨立表達(dá)，但當(dāng)融合于Trx的3＇端時可高效表達(dá)，表明該基因的5＇端序列影響轉(zhuǎn)錄或翻譯。當(dāng)通過同義突變將該基因的5＇端30bp內(nèi)的GC含量從60%降低到30%時即實現(xiàn)了高效表達(dá)，表明5＇端序列GC含量過高是sdsFvCAP-1基因低表達(dá)的關(guān)鍵原因，至于是否為所有VH-linker-VL類構(gòu)建的低表達(dá)原因尚需進(jìn)一步研究。

大腸桿菌高效表達(dá)產(chǎn)物一般為不溶的包涵體蛋白，包涵體蛋白的復(fù)性是關(guān)鍵工藝之一。sdsFvCAP-2基因表達(dá)產(chǎn)物也為包涵體蛋白，當(dāng)我們對該產(chǎn)物變性后采用常規(guī)的稀釋復(fù)性法進(jìn)行復(fù)性操作時發(fā)現(xiàn)絕大部分目的蛋白被聚沉了，這可能與在VH-linker-VL間引入了二硫鍵有關(guān)。當(dāng)采用β-環(huán)糊精分子伴侶系統(tǒng)[9]進(jìn)行復(fù)性時即解決了沉淀問題，所獲復(fù)性產(chǎn)物的親和力與母本抗體的基本一致，表明sdsFvCAP蛋白得到了較好的復(fù)性。本研究成功構(gòu)建了二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體，為進(jìn)一步研制氯霉素殘留檢測用試劑提供參考。

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Construction of Disulfide-Stablized Single Chain Variable Fragment Directed against Chloramphenicol

LI Huang-jin，CHEN Wei，ZHAO Lin，CHAI Wei-jia，TANG Wei
(College of Life Science and Biopharmaceuticals, Guangdong Pharmaceuticals University, Guangzhou 510006, China )

Q81

A

1002-6630(2010)21-0271-04

2010-03-16

廣東省科技攻關(guān)計劃項目(2007A020300007-8)；廣東藥學(xué)院科研啟動基金項目(2006SMK06)

李黃金(1964—)，男，副教授，博士，主要從事基因工程藥物與抗體研究。E-mail：lihuangjin@sohu.com