王立芳，張 微，文連奎*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

可降解L-蘋果酸和檸檬酸菌株的篩選及鑒定

王立芳，張 微，文連奎*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

從葡萄園土壤中分離得到一株可降解L-蘋果酸和檸檬酸的菌株，通過對其進(jìn)行降酸能力實驗，測得該菌株對12g/L的L-蘋果酸和檸檬酸的降解率分別達(dá)到93.17%和92.08%。對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定及rDNA-ITS(internal transcribed spacer，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列分析，鑒定該菌株為伊薩酵母屬(Issatchenkia)陸生伊薩酵母種(I.terricola)。對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其最適生長溫度為30℃，最適生長pH值為2.0～5.5。經(jīng)傳代培養(yǎng)10代，其降酸性能和生長特性仍較穩(wěn)定。

降解；L-蘋果酸；檸檬酸；篩選；鑒定

Abstract：A strain (named S8) degrading bothL-malic acid and critic acid was isolated from the soil of the wineyard in Jilin Agricultural University. The abilities of this strain to degrading 12 g/LL-malic acid and critic acid solutions were measured, and deacidification rate was 93.17% forL-malic acid and 92.08% for critic acid. Based on the morphological, physiological and biochemical identification and the rDNA-ITS (internal transcribed spacer) sequence analysis, this stain was classified asIssatchenkia terricola. The investigation of its biological characteristics showed that the optimal temperature and pH for its growth were 30 ℃ and 2.0－5.5, respectively. After passaging of 10 generations, the acid-degrading ability and growth characteristics of this strain were still stable.

Key words：degradation；L-malic acid；critic acid；screening；identification

L-蘋果酸又名L-2-羥基丁二酸，主要存在于蘋果、葡萄和不成熟的山楂等果實中[1]；檸檬酸又名枸櫞酸，主要存在于檸檬、柑橘、菠蘿、山楂等果實中[2]；目前均在食品、化妝品、醫(yī)療等領(lǐng)域[3-4]廣泛應(yīng)用。但是用含酸量高的果實生產(chǎn)的果酒會有酸澀感、品質(zhì)下降[5-7]；此外，L-蘋果酸和檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)排放的廢棄物酸度太高，對環(huán)境造成了嚴(yán)重污染，必須進(jìn)行降酸才能達(dá)到國家規(guī)定的排放標(biāo)準(zhǔn)[8]，因此，在實際生產(chǎn)中對L-蘋果酸和檸檬酸進(jìn)行降解具有重要意義。

目前關(guān)于蘋果酸降酸微生物的報道主要是粟酒裂殖酵母和乳酸菌。粟酒裂殖酵母發(fā)酵能力較弱，且會產(chǎn)生不良?xì)馕禰9]。蘋果酸-乳酸發(fā)酵在實際生產(chǎn)中操作不易控制，且乳酸菌易引起果酒的多種病害[10]。近年來，科學(xué)家致力于降酸基因克隆方面的研究[11-12]，取得了很大成就，但仍有不少問題有待于進(jìn)一步研究。利用微生物降解檸檬酸的報道還很少，趙玉平等[13]以檸檬酸為唯一碳源，篩選到一株能有效降解山楂汁中檸檬酸的菌株。在目前的研究中，尚未見報道能同時對L-蘋果酸和檸檬酸進(jìn)行降解的微生物，本研究從葡萄園土壤中篩選既能降解L-蘋果酸又能降解檸檬酸的菌株，旨在為L-蘋果酸或檸檬酸的降解提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 采樣

土壤樣品取自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄園。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(WL營養(yǎng)培養(yǎng)基)：酵母浸粉0.4g、胰蛋白胨 0.5g、KH2PO40.055g、KCl 0.0425g、無水CaCl20.0125g、FeCl30.00025g、MgSO40.0125g、MnSO40.00025g、L-蘋果酸按需加入，蒸餾水100mL；分離培養(yǎng)基(WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)：酵母浸粉0.4g、胰蛋白胨0.5g、KH2PO40.055g、KCl 0.0425g、無水CaCl20.0125g、FeCl30.00025g、MgSO40.0125g、MnSO40.00025 g、瓊脂2g、L-蘋果酸按需加入，蒸餾水100mL，L-蘋果酸配成溶液與其他培養(yǎng)液分別滅菌后混合倒平板；保藏培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基；菌落形態(tài)觀察用培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；生理生化鑒定用各培養(yǎng)基均參考文獻(xiàn)[14]方法制備。

1.1.3 試劑及試劑盒

L-蘋果酸(分析純) Bio Basic 公司；檸檬酸(分析純)北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；AxyPrep基因組DNA小量抽提試劑盒 愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；DNA MarkerDL2000、引物ITS1和ITS4、即用PCR擴增試劑盒、UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒 上海生工生物工程服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 降酸菌的篩選與分離

富集：將土壤加入無菌生理鹽水充分振蕩，取適量靜置后的上清液加入到以L-蘋果酸為唯一碳源的富集培養(yǎng)基中，30℃，150r/min培養(yǎng)24h后，移取適量菌液轉(zhuǎn)接入L-蘋果酸質(zhì)量濃度4g/L新鮮富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次，同時L-蘋果酸質(zhì)量濃度由4、6、8、10g/L逐漸遞增到12g/L。

篩選：取適量富集菌液，用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，選擇10-4、10-5、10-6三個稀釋度，分別吸取50μL稀釋液涂布于L-蘋果酸質(zhì)量濃度為 12g/L的分離平板培養(yǎng)基上，每個稀釋度涂布3個平板，30℃倒置培養(yǎng)48h。

分離純化：將篩選得到的單菌落用涂布平板法進(jìn)行多次分離純化，獲得的純化菌株再分別接種到以檸檬酸為唯一碳源的WL培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定各菌株對檸檬酸的降解能力。經(jīng)10次傳代培養(yǎng)后，測定其對L-蘋果酸和檸檬酸降解的穩(wěn)定性。

酸度測定采用高效液相色譜法[15]，降酸率以L-蘋果酸或檸檬酸降酸前后的質(zhì)量濃度差與降酸前質(zhì)量濃度的百分比表示。

1.2.2 降酸菌的形態(tài)及生理生化鑒定

對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定，具體方法參照《真菌鑒定手冊》[16]。

1.2.3 降酸菌的分子生物學(xué)鑒定

參照文獻(xiàn)[17]方法對菌株的5.8S rDNA-ITS序列進(jìn)行分析。

1.2.3.1 總DNA提取

利用AxyPrep基因組DNA小量抽提試劑盒進(jìn)行總DNA的提取。

1.2.3.2 PCR擴增

5.8 S rDNA-ITS序列擴增引物采用真菌通用引物[18]，上游引物為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，下游引物為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)體系為：雙蒸水22μL，2×PCR Master 25μL，引物ITS1 和ITS4(20μmol/L)各1μL，模板DNA 1μL。擴增條件：94℃ 10min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.3.3 PCR產(chǎn)物檢測、純化與測序

擴增完畢后，取5μL的PCR產(chǎn)物與1μL 6×Loading buffer混合，加樣于1.0%的瓊脂糖凝膠點樣孔中進(jìn)行電泳。電泳后，在紫外透射儀下進(jìn)行檢測，若擴增成功，則有亮帶出現(xiàn)。產(chǎn)物經(jīng)UNIQ-10柱式回收試劑盒回收純化后由上海生工生物工程服務(wù)有限公司完成測序。

1.2.3.4 同源性分析

將ITS序列與Genbank中核酸數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行Blast比對分析，找出與目的基因序列同源性最高的菌株，確定菌株的種類。

1.2.4 降酸菌的生長特性

用WL培養(yǎng)基，設(shè)置不同水平的溫度(24～34℃，pH5.0)、pH值(1.5～6.0，最適溫度)，于150r/min振蕩培養(yǎng)48h。通過測定培養(yǎng)液的OD600nm值，分析兩因素對菌株生長的影響。經(jīng)傳代培養(yǎng)10代后，以同樣方法測定其生長特性的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 降酸菌的降酸能力

將分離純化得到的菌株進(jìn)行降酸能力實驗，得到一株對L-蘋果酸和檸檬酸降解能力都很強的菌株，命名為S8。以1%的接種量將菌濃度為2×107CFU/mL的S8菌株依次接種于含有4、6、8、10、12、14、16、18、20g/L的L-蘋果酸(檸檬酸)為唯一碳源的WL營養(yǎng)培養(yǎng)基中，150r/min振蕩培養(yǎng)48h后測定其對不同質(zhì)量濃度L-蘋果酸(檸檬酸)的降解率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌株對不同質(zhì)量濃度L-蘋果酸和檸檬酸的降解率Fig.1 Degradation rates of strain S8 to different concentrations ofL-malic acid and critic acid

由圖1可見，在4～12g/L范圍內(nèi)，菌株對L-蘋果酸和檸檬酸的降解能力相差不大；當(dāng)超過12g/L時，菌株對L-蘋果酸的降解能力變化不大，但對檸檬酸的降解能力卻明顯減弱，這說明檸檬酸質(zhì)量濃度大于12g/L時，已不利于降酸酶發(fā)揮作用，L-蘋果酸則對其影響不大。菌株對12g/L的L-蘋果酸和檸檬酸的降解率分別達(dá)到93.17%和92.08%，其對12g/L以下的檸檬酸和20g/L以下的L-蘋果酸降解率均達(dá)80%以上。經(jīng)傳代培養(yǎng)10代后，測得其降酸性能仍較穩(wěn)定。

2.2 降酸菌的形態(tài)及生理生化特性鑒定

圖2 S8菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain S8 cultured on PDA medium

菌株在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)如圖2所示，菌落為乳白色，呈圓形，大而厚，菌落質(zhì)地均勻，表面光滑、濕潤、黏稠，容易挑起，邊緣整齊，中間稍微凸起，不透明，有面包發(fā)酵氣味。細(xì)胞形態(tài)如圖3所示：細(xì)胞呈橢圓形，繁殖方式為多邊出芽生殖。

圖3 細(xì)胞形態(tài)觀察(×400)Fig.3 Cell morphology of strain S8 (×400)

表1 生理生化實驗結(jié)果Table 1 Physiological and bicochemical properties of strain S8

對S8菌株進(jìn)行生理生化實驗，結(jié)果如表1所示。菌株發(fā)酵葡萄糖既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，發(fā)酵D-木糖、乳糖只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，發(fā)酵甘露醇既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，能利用油脂、檸檬酸鹽、硝酸鹽，具有H2O2活性，不能水解淀粉，不能液化明膠，分解葡萄糖不產(chǎn)生有機酸和乙酰甲基甲醇，不能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，對氨基酸沒有脫氨和脫羧作用，分解含硫氨基酸或無機硫化物不釋放SO2，不具有氧化酶活性。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[19]，S8菌株的形態(tài)特征和生理生化特征與陸生伊薩酵母(I．terricola)幾乎完全相同。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 PCR產(chǎn)物檢測與序列測定

圖4 菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Agarose gel electropherogram of PCR product of strain S8

將純化后的PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在紫外燈照射下觀察結(jié)果如圖4所示，樣品條帶出現(xiàn)在250bp和500bp之間，大小為400bp左右。

2.3.2 同源性分析

將菌株的5.8S rDNA-ITS序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行Blast比對分析，同源性超過99%的菌株如表2所示。

表2 5.8S rDNA-ITS序列基因組相似菌株Table 2 Analysis of homology amongIssatchenkiastrains based on 5.8S rDNA-ITS sequence

由表2可見，與菌株同源性超過99%的菌株均為陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola)，由此鑒定S8菌株為伊薩酵母屬(Issatchenkia)陸生伊薩酵母種(I. terricola)(Genbank登錄號為HM355830)。

2.4 降酸菌的生長特性

2.4.1 最適生長溫度

由圖5可知，培養(yǎng)溫度在26～34℃時，S8菌株均可生長，但30℃時菌體生物量最大，因此選擇30℃為S8菌株的最適生長溫度。

圖5 培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響Fig.5 Effect of culture temperature on growth of strain S8

2.4.2 最適生長pH值

圖6 培養(yǎng)液pH值對菌株生長的影響Fig.6 Effect of medium pH on growth of strain S8

由圖6可知，在pH2～5.5范圍內(nèi)菌體數(shù)量較多且相差不大，而在pH＜2和pH＞5.5時菌體數(shù)量均開始減少，因此選擇最適生長pH值為2～5.5。經(jīng)10次傳代培養(yǎng)后，其生長特性仍較穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

經(jīng)過富集、篩選、分離純化，得到一株既能降解L-蘋果酸又能降解檸檬酸的菌株，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征及5.8S rDNA-ITS序列分析，鑒定該菌株為伊薩酵母屬(Issatchenkia)陸生伊薩酵母種(I. terricola)。通過降酸能力測定，其對12g/L以下的檸檬酸和20g/L以下的L-蘋果酸降解率均達(dá)80%以上。對該菌株生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，其最適生長溫度為30℃，最適生長pH值為2.0～5.5。

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Screening and Identification of a Strain DegradingL-Malic Acid and Critic Acid

WANG Li-fang，ZHANG Wei，WEN Lian-kui*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Q93.331

A

1002-6630(2010)21-0279-04

2010-07-05

吉林省科技廳重點項目(20090228)

王立芳(1984—)，女，碩士研究生，主要從事食品微生物及生物技術(shù)研究。E-mail：lifang9110@163.com

*通信作者：文連奎(1962—)，男，教授，博士，主要從事長白山野生資源的開發(fā)利用研究。E-mail：wenliankui@163.com