張 鶴，趙 雨*，徐云鳳，李蕓彤，趙大慶

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長(zhǎng)春 130117)

梅花鹿鹿筋膠原蛋白提取工藝條件優(yōu)化

張 鶴，趙 雨*，徐云鳳，李蕓彤，趙大慶

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長(zhǎng)春 130117)

為應(yīng)用胃蛋白酶酶解法從鹿筋中提取制備膠原蛋白。采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)篩選出鹿筋膠原蛋白提取的最佳條件為醋酸體積分?jǐn)?shù)5.5%、料液比1:7(mL/g)、浸提時(shí)間14h，胃蛋白酶與底物比1:1000(g/g)、酶解時(shí)間24h。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本方法提取的鹿筋膠原蛋白收率為74.56%，蛋白含量為65.54%。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選所得梅花鹿鹿筋膠原蛋白提取工藝，方法簡(jiǎn)便，提取率高。

鹿筋；膠原蛋白；胃蛋白酶；高效凝膠色譜

Abstract：Pepsin hydrolysis was used to extract and prepare collagen from deer tendons. The optimal extraction conditions were explored by single factor experiments and orthogonal experiments to be acetic acid concentration of 5.5%, material-to-liquid ratio of 1:9, extraction time of 10 h, pepsin-substrate ratio of 1:1000, and hydrolysis time of 24 h. The yield of deer tendon collagen was 74.56% and protein content was 65.54%. The optimized extraction method for deer tendon collagen was characteristic of simple operation and high extraction rate.

Key words：deer tendon；collagen；pepsin；HPGFC

鹿筋是鹿科動(dòng)物梅花鹿(Cervus nipponTemminck)的四肢干燥筋，始載于《唐本草》[1]，用于治療腎虛手足無(wú)力、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、勞損、轉(zhuǎn)筋等癥。膠原(collagen)是細(xì)胞外基質(zhì)的一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，占人體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%～30%，相當(dāng)于人體質(zhì)量的6%，是構(gòu)成皮膚、韌帶、軟骨、肌腱等結(jié)締組織或器官的主要成分，起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的功能。膠原具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，相對(duì)分子質(zhì)量大約為30萬(wàn)，不溶于水；膠原蛋白是膠原的水解產(chǎn)物，具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量，可溶于冷水，并且易降解，易被人體消化吸收[2]。近年來(lái)膠原蛋白不僅在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3]，現(xiàn)有研究表明其具有降血壓、抗衰老、增加骨密度、降低甘油三酯和膽固醇的功能，并且可以補(bǔ)充體內(nèi)某些必需的微量元素等多種生理活性[4-6]。目前，關(guān)于膠原蛋白提取工藝的研究報(bào)道很多[7-9]，本實(shí)驗(yàn)主要研究酶法提取鹿筋中膠原蛋白，為揭示鹿筋的臨床功效以及開(kāi)發(fā)功能產(chǎn)品提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梅花鹿鹿筋 吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn)；胃蛋白酶(1:3000)、牛血清白蛋白 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；凝膠色譜柱標(biāo)準(zhǔn)分子量試劑(相對(duì)分子質(zhì)量依次為6500、13700、29000、43000、75000) GE Healthcare公司；Folin酚試劑 上海荔達(dá)生物技術(shù)有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸鈉 美國(guó)Fluka公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1100型高效液相色譜儀 美國(guó)Aglient公司；TSKgelG2000SW(XL)凝膠色譜柱 Tosoh公司；Uvmini-1240紫外分光光度計(jì) 日本島津儀器有限公司；PHS-25數(shù)顯酸度計(jì)、PL230電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-20B臺(tái)式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；LL3000凍干機(jī) 瑞典Jouna Nordic公司；DZKW恒溫水浴箱 北京市永光明醫(yī)療儀器；WFO烘箱 上海愛(ài)郎儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鹿筋的處理

將新鮮鹿筋去脂肪、皮和筋膜后，切成0.5～1cm3的小塊，然后用生理鹽水反復(fù)清洗去除血和脂肪，再用蒸餾水沖洗干凈，置－20℃冰箱中保存。

1.3.2 鹿筋膠原蛋白提取工藝

將鹿筋解凍，酸溶液浸泡好后，置于100℃沸水浸提至其完全溶解，將水解液離心(4000r/min、30min、30℃)，向上清液中加入胃蛋白酶，37℃酶解，酶解得到膠原蛋白，加熱使酶解液溫度達(dá)到80℃以上10min，使胃蛋白酶失活。離心(4000r/min、30min、4℃)后的上清液用NaOH溶液調(diào)pH7～7.5，濃縮，0.45μm濾膜過(guò)濾，濾液凍干，所得為鹿筋膠原蛋白。

1.3.3 提取膠原蛋白的評(píng)價(jià)指標(biāo)

當(dāng)酸的量不足時(shí)，鹿筋在100℃沸水中不會(huì)完全溶解，結(jié)果導(dǎo)致膠原蛋白提取率降低；若酸的量適中時(shí)，鹿筋在100℃沸水中可以完全溶解；若酸的量過(guò)高時(shí)，則導(dǎo)致部分氨基酸結(jié)構(gòu)破壞，如谷氨酰胺、天冬酰胺和色氨酸殘基會(huì)被破壞，因此浸提液醋酸體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提時(shí)間以鹿筋在100℃沸水中完全溶解所用時(shí)間作為評(píng)價(jià)指標(biāo)；酶解條件的選擇是應(yīng)用高效凝膠色譜法，依據(jù)膠原水解后的相對(duì)分子質(zhì)量分布確定最佳的胃蛋白酶用量及酶解時(shí)間。

1.3.4 蛋白含量測(cè)定

采用Folin-酚試劑盒測(cè)膠原蛋白含量。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 不同醋酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取的影響

稱(chēng)取30g鮮鹿筋5份，加入配好的體積分?jǐn)?shù)0.57%、1%、3%、5%、8%醋酸溶液500mL，4℃浸泡2d后，100℃沸水浸提，根據(jù)鹿筋在100℃沸水中完全溶解時(shí)間來(lái)確定浸提鹿筋的最佳醋酸體積分?jǐn)?shù)。

1.3.5.2 不同料液比對(duì)提取的影響

稱(chēng)取30g鮮鹿筋5份，按料液比1:5、1:6、1:8、1:10、1:12(g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)5%的醋酸溶液，4℃浸泡2d后，100℃沸水浸提，根據(jù)鹿筋在100℃沸水中完全溶解時(shí)間來(lái)確定醋酸浸提鹿筋的最佳料液比。

1.3.5.3 浸提時(shí)間對(duì)提取影響

稱(chēng)取30g鮮鹿筋5份，按料液比1:8，加入體積分?jǐn)?shù)5%的醋酸溶液置于4℃冰箱中，分別浸泡6、12、24、36、48h后，100℃沸水浸提，根據(jù)鹿筋在100℃沸水中完全溶解時(shí)間來(lái)確定醋酸浸提鹿筋的最佳浸提時(shí)間。

1.3.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)醋酸體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、浸提時(shí)間(C)3個(gè)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)鹿筋膠原蛋白提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.7 酶量、酶解時(shí)間的選擇(高效凝膠色譜法)

1.3.7.1 高效凝膠色譜條件

色譜柱為T(mén)SKgelG2000SW(XL)；流動(dòng)相為0.1mol/L Na2HPO4、0.1mol/L NaH2PO4、0.1mol/L Na2SO4，pH6.6；流速為0.5mL/min；進(jìn)樣量為20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。

1.3.7.2 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線

含有5種不同相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的溶液(相對(duì)分子質(zhì)量依次為6500、13700、29000、43000、75000)，按上述高效液相凝膠色譜條件進(jìn)樣。以相對(duì)分子質(zhì)量為橫坐標(biāo)、保留時(shí)間為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y=－0.0788x+21.36，r=0.9975。

1.3.7.3 酶量、酶解時(shí)間的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

配制質(zhì)量濃度為0.01g/mL胃蛋白酶溶液，用HCl溶液調(diào)pH1.90。取3mL鹿筋100℃沸水浸提液按酶與底物比為1:500、1:800、1:1000、1:1500(g/g)，加入胃蛋白酶溶液，37℃酶解24h，分別在0、6、12、24h時(shí)取樣100 μL，加100μL流動(dòng)相溶液，混勻后，0.2μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 醋酸體積分?jǐn)?shù)的確定

圖1 不同醋酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)完全溶解時(shí)間的影響Fig.1 Effect of acetic acid concentration on deer tendon collagen extraction (reflected by required time for complete dissolution of deer tendon in 100 ℃ water, hereinafter the same)

根據(jù)圖1可以看出，隨著醋酸體積分?jǐn)?shù)的增加鹿筋完全溶解時(shí)間減少，5%與8%完全溶解時(shí)間相差很小，因此采用醋酸體積分?jǐn)?shù)為5%。

2.1.2 料液比的確定

從圖2可以看出，料液比越低完全水解所用時(shí)間越短，增加醋酸會(huì)引入更多的鹽，降低蛋白含量，綜合考慮選取料液比為1:8。

圖2 不同料液比對(duì)完全溶解時(shí)間的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on deer tendon collagen extraction

2.1.3 浸提時(shí)間的確定

圖3 浸提時(shí)間對(duì)完全溶解時(shí)間的影響Fig.3 Effect of extraction time on deer tendon collagen extraction

從圖3可以看出，6h水煮時(shí)間較長(zhǎng)，而12、24、36h完全溶解時(shí)間相差很少，所以綜合考慮選取浸提時(shí)間為12h。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定正交試驗(yàn)的因素和水平見(jiàn)表1。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

表2結(jié)果表明，影響鹿筋中膠原蛋白提取的各因素主次順序是A＞C＞B；表3結(jié)果表明，A和C因素對(duì)鹿筋膠原蛋白提取影響有顯著性(P＜0.05)，而B(niǎo)因素影響較小(P＞0.05)，對(duì)于料液比可根據(jù)實(shí)際情況加以選擇，本實(shí)驗(yàn)選擇的料液比為1:7。因此，優(yōu)選出最佳的提取工藝為A3C3B1，即醋酸體積分?jǐn)?shù)為5.5%、浸提時(shí)間為14h、料液比為1:7。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design layout and experimental results

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis for deer tendon collagen extraction with various extraction conditions

2.3 酶量的確定

圖4 不同酶量水解鹿筋膠原的高效凝膠色譜圖Fig.4 HPGFC chromatograms of hydrolyzed collagen at different pepsin-to-substrate ratios

從圖4可以看出，未酶解時(shí)樣品洗脫峰的保留時(shí)間為20.50min；酶與底物比1:1500、24h樣品峰的保留時(shí)間在22.71min；酶與底物比1:1000、24h樣品峰的保留時(shí)間在24.70min和29.56min；酶與底物比1:800、24h樣品峰的保留時(shí)間在24.03min和30.23min；酶與底物比1:500、24h樣品峰的保留時(shí)間在24.20min和30.39min。從此數(shù)據(jù)可以看出，鹿筋膠原隨著酶量的增加，酶解后膠原蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量逐漸降低，而1:1000、1:800和1:500樣品水解程度相差較小。綜合考慮選用酶與底物比1:1000。

2.4 酶解時(shí)間的確定

圖5 不同酶解時(shí)間水解鹿筋膠原的高效凝膠色譜圖(酶與底物比1:1000樣品)Fig.5 HPGFC chromatograms of hydrolyzed collagen at different hydrolysis time points (1:1000 pepsin-to-substrate ratio)

從圖5可以得出，未酶解時(shí)樣品洗脫峰的保留時(shí)間為20.50min，由1.3.6.2節(jié)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可得，此時(shí)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量主要為10910。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品的水解程度不斷增加，酶解24h樣品峰的保留時(shí)間為24.70min和29.56min，此時(shí)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量主要在6500以下，說(shuō)明水解較好，大分子的膠原已完全水解成小分子的膠原蛋白。綜合考慮最佳的酶解時(shí)間為24h。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

綜上所得的最佳工藝為醋酸體積分?jǐn)?shù)5.5%、料液比1:7(mL/g)、浸提14h，胃蛋白酶與底物比為1:1000(g/g)、酶解24h。稱(chēng)取已處理好的鮮鹿筋30g，按最佳提取工藝加入5.5%醋酸210mL浸提14h，將浸泡后的鹿筋于100℃沸水浸提至其完全水解，將水解液離心(4000r/min、30min、30℃)，向上清液中加入胃蛋白酶0.03g，37℃酶解24h，酶解得到膠原蛋白，加熱使酶解液溫度達(dá)到80℃以上10min，使胃蛋白酶失活。離心(4000r/min、30min、4℃)后的上清液用NaOH溶液調(diào)pH7～7.5，濃縮，0.45μm濾膜過(guò)濾，濾液凍干，稱(chēng)量，計(jì)算膠原蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Verification of optimized extraction conditions of deer tendon collagen

從表4可以看出，3組樣品平均膠原蛋白收率為74.56%，平均蛋白含量為65.54%。

3 討 論

由于膠原是不溶于水的高分子質(zhì)量物質(zhì)，中性條件下將它直接通過(guò)鹿筋組織中提取出來(lái)較為困難，而膠原可在酸性或堿性條件下發(fā)生酸膨脹或堿膨脹，破壞膠原肽鏈間的氫鍵和離子鍵乃至共價(jià)鍵，使膠原結(jié)構(gòu)松散，易溶于熱水，并易被蛋白酶水解。在此過(guò)程中，pH值對(duì)其影響很大[10-11]。一般情況下，堿水解得到的大多數(shù)是D-氨基酸或外消旋氨基酸，得到的蛋白已失去了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[12]；酸水解時(shí)若酸的量過(guò)高時(shí)，則導(dǎo)致部分氨基酸結(jié)構(gòu)破壞，如谷氨酰胺、天冬酰胺和色氨酸殘基會(huì)被破壞。因此對(duì)于提取鹿筋中膠原蛋白選擇適宜的浸提液條件很重要。醋酸為弱酸，低濃度的醋酸對(duì)氨基酸結(jié)構(gòu)影響較小，且有報(bào)道表明采用醋酸提取膠原蛋白，提取率較高[13]。

在人體中，胃蛋白酶是一種消化性蛋白酶，由胃中的胃黏膜主細(xì)胞分泌，酶切蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸或酸性氨基酸所形成的肽鍵，可將食物中的蛋白質(zhì)分解成易被人體吸收的小肽段。本實(shí)驗(yàn)采用胃蛋白酶水解鹿筋膠原，模擬胃液環(huán)境，使水解得到的膠原蛋白更易被人體消化吸收[14-15]。

高效凝膠色譜柱是根據(jù)分子篩原理，測(cè)定蛋白分子質(zhì)量分布。本實(shí)驗(yàn)酶解鹿筋膠原時(shí)胃蛋白酶的酶量和酶解時(shí)間都是應(yīng)用高效凝膠色譜法，得到水解樣品洗脫峰的保留時(shí)間，依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定最佳的胃蛋白酶用量及酶解時(shí)間。此方法確定樣品酶解條件方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)鹿筋膠原蛋白的提取工藝進(jìn)行了研究，得到最佳工藝是醋酸體積分?jǐn)?shù)為5.5%、料液比為1:7(g/mL)、浸提14h、胃蛋白酶與底物比是1:1000(g/g)、酶解時(shí)間為24h，酶解得到鹿筋膠原蛋白收率為74.56%，蛋白含量為65.54%。在酶解后的濃縮，調(diào)中性過(guò)程中有少量的鹽和灰分等成分引入，對(duì)產(chǎn)品的純度產(chǎn)生了一定的影響。因此在實(shí)際生產(chǎn)中還應(yīng)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的純化處理。

[1] 蘇敬. 唐本草[M]. 上海:上海衛(wèi)生出版社, 1957:210.

[2] 蔣挺大, 張春萍. 膠原蛋白[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2001:29.

[3] 薛艷麗. 膠原蛋白與美容[J]. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥, 2006, 1(9):84.

[4] 陳靜濤, 徐政, 顧其勝. 膠原蛋白研發(fā)的最新進(jìn)展[J]. 上海生物醫(yī)學(xué)工程, 2004, 25(2):52-55.

[5] 任俊莉, 付麗紅, 邱化玉. 膠原蛋白應(yīng)用及其發(fā)展前景[J]. 中國(guó)皮革,2004, 33(1):36-38.

[6] 李彥春, 程寶箴, 靳立強(qiáng). 膠原蛋白的應(yīng)用[J]. 皮革化工, 2002, 19(3):11-14.

[7] 王信蘇, 汪之和. 草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白的提取[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2006(4):148-150.

[8] 趙勝年. 酶解鮮豬皮提取水解膠原蛋白的研究[J]. 食品工業(yè)科技,1998(5):16-17.

[9] 王建輝, 李琦, 劉在群, 等. 鹿皮膠原的提取與性質(zhì)[J]. 吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 2001(1):106-108.

[10] 位紹紅, 許永安. 明膠提取工藝及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 福建水產(chǎn),2007(2):67-71.

[11] 呂坪, 杜玉枝, 魏立新. 酶法制備明膠的研究進(jìn)展[J]. 明膠科學(xué)與技術(shù), 2006, 26(4):170-175.

[12] 張應(yīng)年, 李生英, 朱彥榮. 人體必需氨基酸消旋化作用分析及應(yīng)用[J]. 中國(guó)食品與營(yíng)養(yǎng), 2005(11):26-28.

[13] 羅發(fā)興, 薛新順, 羅志剛. 酸溶液對(duì)豬皮中膠原蛋白溶出率的影響[J]. 中國(guó)釀造, 2006(9):9-11.

[14] 王川, 李燕, 馬志英, 等. 幾種酶法從豬皮中提取膠原蛋白的對(duì)比研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(1):201-204.

[15] 菅景穎, 張志勝. 酶解膠原蛋白研究進(jìn)展[J]. 肉類(lèi)研究, 2005(5):26-28.

Optimization of Extraction Conditions for Deer Tendon Collagen

ZHANG He，ZHAO Yu*，XU Yun-feng，LI Yun-tong，ZHAO Da-qing
(Chinese Medicine and Bio-engineering Research Center, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

R284.2

A

1002-6630(2010)18-0014-04

2009-12-23

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAI38B06)；吉林省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20096042)

張鶴(1985—)，女，碩士研究生，主要從事中藥有效成分研究。E-mail：zhang_he_19850123@163.com

*通信作者：趙雨(1972—)，男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究。E-mail：cnzhaoyu@yahoo.com.cn