丁敬華,吳 輝,張穎花,陳再興,暢 蓓,石松田,姜 泓

(1.中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,遼寧沈陽110001; 2.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧沈陽110001)

大鼠服用朱砂后腦內(nèi)氨基酸類遞質(zhì)含量的變化

丁敬華1,吳 輝1,張穎花1,陳再興2,暢 蓓1,石松田1,姜 泓1＊

(1.中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,遼寧沈陽110001; 2.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧沈陽110001)

研究了朱砂對(duì)大鼠腦組織中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響.將32只Wistar大鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量組和對(duì)照組,朱砂灌胃給藥14天后,采用高效液相色譜法測(cè)定大鼠腦組織中谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、γ-氨基丁酸(GABA)和?；撬?Tau)的含量,并計(jì)算興奮毒性指數(shù)(EI)的變化.與對(duì)照組相比較,腦組織中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量均呈下降趨勢(shì),其中Asp和 Gly的中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Tau和 GABA的高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),Glu和 EI所有劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).朱砂對(duì)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)具有一定的抑制作用.

朱砂;大鼠;腦組織;氨基酸類遞質(zhì)

朱砂(cinnabar)最早見于我國第一部藥物學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有清心鎮(zhèn)驚,安神解毒之功效,是常用中藥,臨床應(yīng)用廣泛,主要用于治療心悸易驚,失眠多夢(mèng),癲癇發(fā)狂,小兒驚風(fēng),視物昏花,口瘡,喉痹,瘡瘍腫毒[1].雖然朱砂在中醫(yī)用藥中占有重要地位,但是隨著汞毒性研究的進(jìn)展和人們對(duì)食品藥品安全衛(wèi)生問題的日益重視,含汞中藥朱砂潛在的毒性也越來越引起人們的關(guān)注.祖國醫(yī)藥學(xué)對(duì)朱砂毒性的認(rèn)識(shí),經(jīng)歷了由“無毒”到“有毒”,到目前“限量”使用的過程,《本草備要》記載“朱砂多服令人癡呆”.中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)大部分神經(jīng)遞質(zhì)是氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì),谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和?；撬?Tau)是腦部重要的神經(jīng)遞質(zhì),這些氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化可以反映出許多疾病的病理、生理過程[2-5].因此,測(cè)定這些氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化對(duì)于研究朱砂對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒/藥理機(jī)制具有極其重要的參考價(jià)值.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品、材料與儀器

市售朱砂,胃蛋白酶(活度1∶3 000,美國華美生物工程公司),考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所),Glu、Asp、GABA、Gly和 Tau(Sigma公司),甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純.Wistar大鼠32只(中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供),體重150±10 g,雌雄各半.

高效液相色譜儀(美國Waters公司),包括600泵,2475熒光檢測(cè)器;ER-182A全自動(dòng)電子天平 (十萬分之一)(日本A&D公司);組織勻漿器(IKA廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司);3K-18超速冷凍離心機(jī)(Sigma公司);p H-3c型酸度計(jì)(上海精密科學(xué)實(shí)業(yè)有限公司);722s型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);KQ-218超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Easypure純水系統(tǒng)(美國Barnstead公司).

1.2 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱(150 mm ×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相:A相為甲醇,B相為0.1 mol/L醋酸鉀溶液,流動(dòng)相均以0.45μm濾膜過濾,超聲脫氣后使用,梯度洗脫為0～2 min內(nèi)A相從20%線性增加至47%,2～11 min內(nèi)從47%增加至53%,11～14 min內(nèi)增加至100%,然后以A相洗脫5 min,再以A相20%平衡5 min.流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長:λex=250 nm,λem=395 nm;柱溫:35 ℃.進(jìn)樣量:20μL.

1.3 衍生試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將20 mg鄰苯二甲醛(OPA)、0.5 mLβ-巰基乙醇溶于0.5 mL甲醇中,再加入9 mL硼酸緩沖液 (0.4 mol/L p H 10.5)制得衍生試劑,室溫下密封,避光保存.

準(zhǔn)確稱取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品適量,用1 mmol/L NaOH溶解,稀釋,配成氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液(Glu、Asp、GABA和 Tau濃度為800μmol/L,Gly濃度為200μmol/L),用時(shí)稀釋.取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液100μL,加入衍生試劑200μL,混勻,靜置2 min,進(jìn)樣,以保留時(shí)間定性,峰面積外標(biāo)法定量.

1.4 分組及給藥方法

Wistar大鼠32只,體重150±10 g,雌雄各半.按體重隨機(jī)分成4組,每組8只.以0.3%CMC-Na水溶液為混懸介質(zhì),對(duì)照組(0.3%CMC-Na水溶液)、實(shí)驗(yàn)用藥組(1 g/kg,2 g/kg,4 g/kg)灌胃給藥,每日1次,灌胃14天.在動(dòng)物灌胃期間每3天稱重1次,調(diào)節(jié)灌胃劑量.所有動(dòng)物均自由飲水和進(jìn)食普通飼料.

1.5 樣品采集及處理

最后一次灌胃2 h后,10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,迅速開顱取大腦(冰浴下進(jìn)行).取腦組織100 mg,加9倍預(yù)冷生理鹽水勻漿5 min,冰浴下超聲腦組織,4℃離心(3 500 r/min)20 min,取上清液,稀釋,精密吸取100μL稀釋液加考馬斯亮藍(lán)溶液5 mL,進(jìn)行蛋白定量.另取上清液4℃離心(10 000 r/min)20 min,稀釋,精密吸取稀釋液100μL,加OPA衍生試劑200μL,混勻,靜置2 min.注入高效液相色譜儀中進(jìn)行梯度洗脫.

1.6 興奮性毒性指數(shù)(EI)的計(jì)算[6]

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS12.0軟件單因素方差分析方法(ANOVA)進(jìn)行各指標(biāo)組間差異的顯著性檢驗(yàn).

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

五種氨基酸在本實(shí)驗(yàn)條件下15 min內(nèi)得到較好分離,色譜圖見圖1.

圖1 5種氨基酸的 HPLC圖Fig.1 HPLC graph of 5 amino acids

以進(jìn)樣量(x)對(duì)樣品的峰面積(y)進(jìn)行回歸,求得回歸方程,結(jié)果 Glu在2～20μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(y=402 914.16+513 719.34x,r=0.997 2);Gly在0.5～5μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(y=341 276.99+178 754.48x,r=0.999 9);Asp在2～20μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(y=-64 381.36+221 665.87x,r=0.993 0);GABA在 2～20μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(y=-235 426.96+869 648.80x,r=0.999 4);Tau在2～20μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(y=197 068.59+1 028 694.44x,r=0.999 3).

2.2 朱砂對(duì)大鼠腦組織氨基酸含量及興奮毒性指數(shù)的影響

對(duì)大鼠連續(xù)灌胃14天后,腦組織中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量(表1)均呈下降趨勢(shì).與對(duì)照組相比較,Asp和Gly的中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Tau和 GABA的高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),Glu和EI所有劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).

表1 腦組織中氨基酸含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Contents of amino acids in brain

2.3 色譜條件和衍生化條件的選擇

本研究采用OPA柱前衍生、反相高效液相色譜-熒光檢測(cè)法對(duì)氨基酸進(jìn)行梯度洗脫和含量測(cè)定,經(jīng)方法學(xué)考察,結(jié)果靈敏、可靠.

OPA柱前衍生化具有高度靈敏性,但衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定,故實(shí)驗(yàn)過程中要嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間,結(jié)果表明2 min時(shí)較為穩(wěn)定,故在實(shí)驗(yàn)中,以衍生化試劑加入起計(jì)時(shí)到2 min時(shí)進(jìn)樣.另外,OPA試劑本身無熒光,過量加入以保證衍生反應(yīng)完全,且對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響.

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大鼠服用朱砂后腦組織中5種氨基酸含量均呈降低趨勢(shì),GABA和 Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì).Glu為興奮性神經(jīng)遞質(zhì),具有神經(jīng)毒性,降低趨勢(shì)較明顯,其主要原因可能與朱砂鎮(zhèn)靜安神的功效有關(guān),另一方面可能是由于朱砂中汞的毒性使大鼠處在應(yīng)激狀態(tài)下,中樞神經(jīng)系統(tǒng)Glu含量降低可以視為機(jī)體自身的保護(hù)機(jī)制[6],具體原因有待于進(jìn)一步研究.GABA是以 Glu為底物經(jīng)谷氨酸脫羧酶脫羧而成,具有抗焦慮和抗驚厥的作用,是腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì).GABA降低的原因一方面可能是由于底物 Glu含量的降低,而使 GABA的含量降低.

另一方面的原因可能是腦內(nèi)的一種被動(dòng)的自身性保護(hù)作用,糾正中樞神經(jīng)興奮性/抑制性神經(jīng)遞質(zhì)比值,減輕毒性作用引起的神經(jīng)細(xì)胞損害,但二者(興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì))仍處于一種失衡狀態(tài).Tau有多種生理功能,如促進(jìn)大腦智力發(fā)育、改善學(xué)習(xí)記憶能力、抗脂質(zhì)過氧化、對(duì)抗各種化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損害等作用[7],Tau含量的降低是朱砂的神經(jīng)系統(tǒng)毒性的表現(xiàn)之一.

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:92.

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Effects of Cinnabar on Content of Amino Acids Neurotransmitters in Brain Tissues of Rats

DINGJing-hua,WU Hui,ZHANG Ying-hua,CHEN Zai-xing,CHANG Bei,SHI Song-tian,J IAN G Hong
(1.School ofPublic Health,China Medical University,Shenyang110001,Liaoning,China;2.School of Pharmaceutical Sciences,China Medical University,Shenyang110001,Liaoning,China)

The effect of cinnabar on the content of amino acids neurotransmitters in rat brains was investigated.Thus 32 Wister rats were categorized into 4 groups randomly,8 rats each group,including low dosage group,moderate dosage group,high dosage group,and control group.The three groups of to-be-tested rats were treated with cinnabar by gastric perfusion at a dosage of 1 g/kg,2 g/kg,and 4 g/kg;and the control group ones were allowed to orally take the same volume of 0.3%sodium carboxymethylcellulose(CMC-Na).After 14 day treatment,the content of glutamate(Glu),aspartate(Asp),glycine(Gly),γ-aminobutyric acid(GABA)and taurine(Tau)in brain tissues of the rats were determined by means of high-performance liquid chromatograph;and the variation of excitation toxicity index(ETI)was calculated.Results indicate that,as compared with the rats of control group,the content of amino acids neurotransmitters in the brain tissues of the three groups of tested rats tends to decrease,which indicates that cinnabar has some inhibition action to amino acids neurotransmitters.Namely,the content of Glu in the brain tissues of all the three tested groups of rats is significantly decreased(P<0.05),that of Asp and Gly is significantly decreased at a dosage of 2 g/kg and 4 g/kg(P<0.05),and that of Tau and GABA are significantly decreased at a dosage of 4 g/kg(P<0.05),showing statistical significance.

cinnabar;rat;brain tissues;amino acids neurotransmitters

O 613.63

A

1008-1011(2010)05-0082-03

2010-05-14.

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20092133).

丁敬華(1982-),女,碩士生,研究方向:含重金屬礦物藥毒作用機(jī)制研究.＊

,E-mial:jianghong@mail.cmu.edu.cn.