張 凡,佘躍惠,孔淑瓊,舒福昌,喻高明,侯讀杰

(1.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(北京)能源學(xué)院,北京100080;2.長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北荊州434023)

天然氣庫(kù)上方土壤微生物群落研究

張 凡1,佘躍惠2,孔淑瓊2,舒福昌2,喻高明2,侯讀杰1

(1.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(北京)能源學(xué)院,北京100080;2.長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北荊州434023)

通過(guò)基于16S rRNA基因克隆文庫(kù)的方法研究了天然氣庫(kù)上方土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)。針對(duì)大港油田板876氣庫(kù)上方同一取樣點(diǎn)1.0 m和2.0 m的土壤樣品構(gòu)建了16S rDNA克隆文庫(kù)DGS1和DGS2,并對(duì)其150個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行限制性酶切片段長(zhǎng)度多樣性分析(ARDRA)。結(jié)果表明,克隆文庫(kù)DGS1有40個(gè)操作分類(lèi)單元(OTU),克隆文庫(kù)DGS2有39個(gè)OTU,該天然氣庫(kù)上方土壤中微生物較豐富;但由于土壤深度的不同兩個(gè)土壤樣品微生物群落結(jié)構(gòu)存在著差異。每個(gè)OTU的代表克隆序列分析結(jié)果表明,克隆文庫(kù)DGS1中優(yōu)勢(shì)菌群為芽單胞菌(Gemmatimonadetes)28%、綠彎菌(Chlorof lexi)23%和放線(xiàn)菌(Actinobacterium)21%;克隆文庫(kù)DGS2菌群分布較平均,其中 Chlorof lexi19%、硫氧化菌(Sulfur-oxidizing)12%、酸酐菌(Acidobacteria)10%、Gemmatimonadetes10%。天然氣庫(kù)上方土壤微生物多樣性的分子分析可為開(kāi)展微生物油氣勘探(MPOG)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

氣庫(kù);16S rRNA基因;克隆文庫(kù);微生物群落;微生物油氣勘探(MPOG)

基于16S rDNA分子生物學(xué)技術(shù)已被廣泛用于研究環(huán)境微生物群落多樣性?？寺『?6S rDNA序列分析能有效地確定研究區(qū)域中未被培養(yǎng)出來(lái)的微生物[1],能夠使人們更準(zhǔn)確全面地認(rèn)識(shí)特定生態(tài)系統(tǒng)中的微生物種群多樣性[2]。

基于16S rDNA的分子生物學(xué)方法已被用來(lái)研究森林、稻田、草原土壤和海湖沉積物中的微生物群落。對(duì)油田微生物群落的研究主要集中在油田產(chǎn)出油水樣、油田地層水樣中的微生物群落[3～5],而對(duì)于油氣田上方土壤中的微生物群落研究報(bào)道卻很少。采用微生物油氣勘探(MPOG)技術(shù)檢測(cè)土壤中烴氧化菌的異常,可以預(yù)測(cè)下伏油氣藏的存在[6,7]。

作者在此通過(guò)構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫(kù)分子,研究了大港油田板876氣庫(kù)上方土壤微生物群落結(jié)構(gòu),為詳細(xì)研究油藏生態(tài)系統(tǒng)中微生物種群組成及開(kāi)展微生物油氣勘探(MPOG)技術(shù)提供了可靠數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 取樣

樣品取自中石油大港油田(天津)板876氣庫(kù)上方土壤樣品。其地層剖面圖如圖1所示。

圖1 板876氣庫(kù)地層剖面Fig.1 G eological base of Ban876 gas reservoir

取樣點(diǎn)距注氣點(diǎn)板876井100 m。氣藏蓋層上部為沙一中、上段地層,全部為暗色泥巖,總厚度200 m左右,平面上,砂體呈席狀分布,氣藏主體部位滲透砂巖厚度 6～9 m?？紫抖?13.0%～24.4%,平均21.1%。滲透率21.0×10-3～398.0×10-3μm2,平均164.5×10-3μm2。氣層受構(gòu)造控制,氣水界面在2244 m處,含氣高度24 m,凝析油含量72.7 g·m-3。氣藏氣層平面上分布連片,連通性好,氣層有效厚度1.2～11.4 m,碾平厚度4.6 m,為構(gòu)造氣藏。天然氣相對(duì)密度為0.6264(設(shè)空氣的密度為1),其中甲烷含量為90%。

分別取取樣點(diǎn)的縱向剖面0.5 m、1.0 m、1.5 m、2.0 m以及2.5 m處的5個(gè)土壤樣品,立即送實(shí)驗(yàn)室, 20℃保存。

1.2 土壤樣品處理以及DNA提取

將新鮮土壤樣品碾碎,充分混勻,分別稱(chēng)取5個(gè)土壤樣品0.5 g各3份,按 Fast DNA Spin Kit for Soil (Qbiogen,Carlsbad,CA.U.S.A)試劑盒說(shuō)明提取樣品總DNA。將每個(gè)樣品的3份DNA混合到一起用DNA濃度測(cè)定儀(Nanodrop?ND-1000 UV-Vis Spectrophoto-meter,Nanodrop Technologies)測(cè)定所提取的DNA濃度。

1.3 16S rRNA基因全長(zhǎng)擴(kuò)增

使用 16S rDNA片段擴(kuò)增通用引物 27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′)和 1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)從基因組總DNA中擴(kuò)增16S rDNA片段。PCR擴(kuò)增體系及程序參見(jiàn)文獻(xiàn)[8]。

1.4 克隆文庫(kù)建立

用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Agarose gel DNA purification kit,TaKaRa Biotechnology,Dalian,China)對(duì)16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行割膠,純化。然后將回收產(chǎn)物16S rDNA片段p GEM T-easy克隆載體(Promega)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞 Escherichia coliJM109 Competentcells(TaKaRa Biotechnology,Dalian, China)中。從兩個(gè)文庫(kù)各挑取150個(gè)陽(yáng)性克隆,挑取少量菌體作為模板,擴(kuò)增每個(gè)克隆的16S rRNA基因。PCR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶 HaeⅢ和 HhaⅠ進(jìn)行酶切,再用2%瓊脂糖凝膠電泳分析限制性片段,然后對(duì)電泳圖譜進(jìn)行限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(ARDRA)分析。將兩種酶切圖譜相同的克隆歸為同一種發(fā)育類(lèi)型,即同一種操作分類(lèi)單元(OTU)。

1.5 克隆文庫(kù)庫(kù)容

應(yīng)用 Rarefaction分析軟件(http://www.uga. edu/strata/software/Software.html)對(duì)克隆文庫(kù)的庫(kù)容飽和度進(jìn)行分析,以檢測(cè)建立的克隆文庫(kù)是否已經(jīng)足夠全面地代表了MOB群落的多樣性。

1.6 測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

挑取ARDRA分型歸為一類(lèi)的克隆接種于含有100μg·mL-1氨芐的液體LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)20 h后送往測(cè)序公司(諾賽基因,北京)。所得序列通過(guò)DNAMAN軟件進(jìn)行處理,然后在National Center for Biotechnology(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/)數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析,尋找親緣關(guān)系最近的序列,用DNAMAN軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣庫(kù)上方土壤微生物群落

在氣庫(kù)上方1.0 m和2.0 m土壤樣品的16S rRNA基因克隆文庫(kù)DGS1和DGS2中各選擇了150個(gè)陽(yáng)性克隆子,通過(guò) HaeⅢ和 HhaⅠ雙酶切分型分別得到了40個(gè)和39個(gè)OTU。Rarefaction分析曲線(xiàn)(圖2)顯示當(dāng)陽(yáng)性克隆子達(dá)到150個(gè)時(shí)曲線(xiàn)趨于水平,說(shuō)明克隆文庫(kù)能夠反映樣品微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖2 克隆文庫(kù)DGS1和DGS2 Rarefaction分析曲線(xiàn)Fig.2 Rarefaction analysis curves of clone libraries DGS1 and DGS2

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖 3、圖4)可知,克隆文庫(kù)DGS1中優(yōu)勢(shì)菌群為單胞菌 (Gemmatimonadetes) 28%、綠彎菌(Chlorof lexi)23%和放線(xiàn)菌(Actinobacterium)21%;克隆文庫(kù)DGS2菌群分布較平均,其主要菌群有 Chlorof lexi19%、硫氧化菌(Sulfur-oxidizing)12%、酸酐菌(Acidobacteria)10%、Gemmatimonadetes10%。所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)比分析,結(jié)果表明,大多數(shù)序列(＞80%)和GenBank中已有的16S rDNA序列同源性小于97%,說(shuō)明該樣品微生物系統(tǒng)中微生物資源比較新穎,很多屬于新的種。

2.2 討論

應(yīng)用16S rRNA基因克隆建庫(kù)方法對(duì)天然氣庫(kù)上方土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究。兩土壤樣品微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異,但微生物種類(lèi)數(shù)(OTUs)較為接近。以前關(guān)于油氣微生物勘探(MPOG)報(bào)道指出油氣田上方土壤中的烴氧化菌中甲烷氧化菌的數(shù)量較其它非油氣田上方多[9,10]。但是本研究中兩個(gè)氣庫(kù)上方土壤樣品克隆文庫(kù)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)烴氧化菌,證明烴氧化菌在氣庫(kù)上方土壤中并非以?xún)?yōu)勢(shì)菌的地位存在。因此要了解油氣田與非油氣田上方土壤中烴氧化菌的差異,必須找到烴氧化菌的特異性引物,從而排除其它微生物的干擾。

大港油田地處渤海之濱是一片鹽堿地,土壤的平均p H值為7.5。兩個(gè)克隆文庫(kù)中的主要微生物種群為 Chlorof lexi、Gemmatimonadetes、A cidobacteria、 Actinobacterium。海洋沉積物以及鹽堿沼澤土壤微生物也包含這些微生物[11～13]。這一結(jié)果證明土壤中的微生物菌群主要是由土壤的地理位置以及土壤的理化性質(zhì)決定。不同油氣田由于其所屬地層的化學(xué)和物理?xiàng)l件不同,其土壤中所含的微生物差異較大。因此, MPOG工作必須開(kāi)展中前期的土壤微生物調(diào)查。

圖3 16S rRNA基因克隆文庫(kù)DGS1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of sequences of the 16S rRNA gene of clone library DGS1

圖4 16S rRNA基因克隆文庫(kù)DGS2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of sequences of the 16S rRNA gene of clone library DGS2

3 結(jié)論

通過(guò)基于16S rRNA基因克隆文庫(kù)的方法研究了天然氣庫(kù)上方土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)。構(gòu)建了16S rDNA克隆文庫(kù)DGS1和DGS2,并對(duì)其150個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行限制性酶切片段長(zhǎng)度多樣性分析(ARDRA)。結(jié)果表明,克隆文庫(kù)DGS1有40個(gè)操作分類(lèi)單元(OTU),克隆文庫(kù)DGS2有39個(gè)OTU,克隆文庫(kù)DGS1中優(yōu)勢(shì)菌群為芽單胞菌(Gemmatimonadetes) 28%、綠彎菌(Chlorof lexi)23%和放線(xiàn)菌(Actinobacterium)21%;克隆文庫(kù)DGS2菌群分布較平均,其中有 Chlorof lexi19%、硫氧化菌 (Sulfur-oxidizing) 12%、酸酐菌(Acidobacteria)10%、Gemmatimonade-tes10%。天然氣庫(kù)上方土壤微生物多樣性的分子分析為開(kāi)展微生物油氣勘探(MPOG)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

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Study on Microbial Community in Soil Above A G as Reservoir

ZHANG Fan1,SHE Yue-hui2,KONGShu-qiong2,SHU Fu-chang2,YU G ao-ming2,HOU Du-jie1
(1.School ofEnergy Resources,China University of Geosciences(Beijing),Beijing100083,China; 2.College of Chemistry and Environmental Engineering,Yangtze University,J ingzhou434023,China)

16S rRNA gene clone library construction was used to analyze the microbial communities of soil sampled from above a known Ban876 gas reservoir.Two clone libraries DGS1 and DGS2 were constructed. There were 150 clones from the two libraries respectively for amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA).40 Taxanomic operational units(OTUs)were found in library DGS1,and 39 OTUs were found in library DGS2.Sequence analysis of the representative clone of each OTU showed that dominant bacteria of the DGS1 were affiliated withGemmatimonadetes28%,Chlorof lexi23%,Actinobacterium21%;andChlorof lexi 19%,Sulfur-oxidizing 12%,Acidobacteria10%,Gemmatimonadetes10%for DGS2,which provides foundation for application of MPOG(Microbial prospecting of oil and gas).

gas reservoir;16S rRNA gene;clone library;microbial community;microbial prospecting of oil and gas(MPOG)

Q 939 Q 785

A

1672-5425(2010)06-0054-05

中石油集團(tuán)公司中青年創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(07E1025)

2010-03-19

張凡(1980-),女,湖北咸寧人,博士研究生,研究方向:石油微生物學(xué);

侯讀杰,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail: bjbios001@126.com。