楊賢慶，劉 剛,2，戚 勃，李來好，郝淑賢，刁石強(qiáng)

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化瓊膠的酸水解條件

楊賢慶1，劉 剛1,2，戚 勃1，李來好1，郝淑賢1，刁石強(qiáng)1

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

采用酸水解法對瓊膠進(jìn)行降解并結(jié)合苯酚-硫酸法測定瓊膠低聚糖的含量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化水解工藝，建立鹽酸濃度(X1)、水解時(shí)間(X2)和固液比(X3)與水解率(Y)之間的數(shù)學(xué)模型：Y=81.5933＋0.7175X1＋1.8938X2＋2.7313X3－3.1567X12－3.3042X22－3.3092X32－0.6625X1X2＋0.0475X1X3－0.8000X2X3，確定瓊膠水解的最佳工藝條件，即鹽酸濃度0.105mol/L、水解時(shí)間96min、固液比4.5:100(g/mL)，在此最佳工藝條件下進(jìn)行水解，瓊膠水解率為81.43%。

瓊膠；酸水解；響應(yīng)曲面法

瓊膠是一種從江蘺、石花菜等紅藻中提取出來的水溶性多糖，由凝膠部分瓊膠糖和非凝膠部分硫瓊膠組成，相對分子質(zhì)量大約為7.0×104～8.0×104，其降解產(chǎn)物——瓊膠寡糖，一般是指聚合度(DP)為3～10的低聚糖，包括瓊寡糖和新瓊寡糖[1-2]。近年來對瓊膠及其寡糖的研究發(fā)現(xiàn)，瓊膠寡糖具有相對分子質(zhì)量小、易被吸收等特點(diǎn)，在抗氧化、抗腫瘤、抗凝血等方面具有顯著的生理活性[3-4]。因此選擇合適的降解條件對瓊膠進(jìn)行降解，得到聚合度分布較窄的瓊膠寡糖就顯得尤為重要。

目前，瓊膠的降解方法主要有酶降解、物理降解和化學(xué)降解[5-6]。酶降解反應(yīng)專一性好，得到的產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布窄，但用于制備瓊膠寡糖的α-瓊膠酶難于獲得，且降解的技術(shù)和條件要求高[7]；物理降解(包括超聲波降解、微波降解和輻射降解)不會改變其結(jié)構(gòu)和組成，但降解過程中的條件不易控制；化學(xué)降解(包括酸降解和氧化降解)相對簡單、成本低，但都會使糖鏈發(fā)生非專一性斷裂，氧化降解還能使糖分子氧化，產(chǎn)物中含有較多的副產(chǎn)物[8]。酸降解目前仍是應(yīng)用最廣泛的方法，可使用的酸包括固態(tài)酸、檸檬酸、鹽酸、硫酸和醋酸等。響應(yīng)曲面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，可確定各因素及其交互作用在工藝過程中對指標(biāo)(響應(yīng)值)的影響，精確地表明因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用溫和條件下的酸水解法對瓊膠進(jìn)行降解，以瓊膠水解率為研究對象，并結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化水解條件，確定瓊膠酸水解的最佳工藝條件，以期為瓊膠的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

瓊膠(食品級) 汕尾市聯(lián)興生物瓊膠食品有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度95%以上) 廣東 汕頭市西隴化工廠；鹽酸、濃硫酸、苯酚、無水乙醇(均為分析純)。

TU-1990雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；3K30型冷凍離心機(jī) Sigma公司；其他均為實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。

1.2 方法

1.2.1 瓊膠低聚糖的制備

稱取不同質(zhì)量的瓊膠粉末，加入100mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，放入105℃高壓滅菌鍋中20min，使瓊膠充分溶解。向其中加入不同體積的1mol/L鹽酸，在90℃條件下反應(yīng)不同的時(shí)間。反應(yīng)完畢后立即用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至中性，7000r/min離心15min除去水不溶性殘?jiān)?，上清液加入無水乙醇，使最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，靜置過夜，7000r/min離心15min除去乙醇不溶性殘?jiān)?，上清液減壓蒸發(fā)近干，加水定容到一定體積，得到瓊膠低聚糖。

1.2.2 瓊膠水解率的測定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[11-13]：精確移取質(zhì)量濃度為 100.0mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL于25mL比色管中，移取不同體積蒸餾水補(bǔ)至2.00mL，分別加入6%苯酚溶液1mL、濃硫酸5mL，搖勻。將比色管放在沸水浴中加熱5min，顯色反應(yīng)，取出在冰水浴中冷卻至室溫，同時(shí)用2.0mL蒸餾水做空白，用分光光度計(jì)在波長490nm處測定吸光度。

瓊膠低聚糖含量與水解率的測定：采用苯酚-硫酸法測定瓊膠低聚糖的含量。瓊膠水解液中低聚糖的含量與水解前加入瓊膠量之比為瓊膠水解率[14]。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

選取對水解率有顯著影響的3個(gè)因素，即鹽酸濃度、水解時(shí)間、固液比進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對響應(yīng)值(瓊膠水解率)有顯著影響的3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。采用Minitab數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。每一個(gè)自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼，該模型通過最小二乘法擬合二次多項(xiàng)方程[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=11.513x－0.0009，R2=0.9975。葡萄糖質(zhì)量濃度在0～0.05g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 鹽酸濃度對水解率的影響

固定固液比1:25(g/mL)、水解時(shí)間90min、水解溫度90℃，考察鹽酸濃度對水解率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 鹽酸濃度對水解率的影響Fig.2 Effect of hydrochloric acid concentration on the yield of agar oligosaccharides

由圖2可見，隨著鹽酸濃度的升高，瓊膠的水解率逐漸增加，在鹽酸濃度0.10mol/L時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)瓊膠水解率為57.84%。隨后有下降的趨勢，可能是由于鹽酸濃度過高導(dǎo)致水解產(chǎn)物發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變[15]。

2.2.2 固液比對水解率的影響

圖3 固液比對水解率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of agar oligosaccharides

在固定溫度90℃、水解時(shí)間90min、鹽酸濃度0.10mol/L的條件下，考察不同的固液比對水解率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可見，在固液比1:100～4:100(g/mL)即底物含量1～4g/100mL之間時(shí)，隨著底物含量的增加，水解率呈現(xiàn)快速升高的趨勢，在固液比1:25(g/mL)時(shí)，瓊膠水解率為50.32%，隨后水解率上升的趨勢逐漸趨于平緩。從原料的利用效率考慮，選取固液比1:25(g/mL)作為瓊膠水解時(shí)的最適底物含量。

2.2.3 水解時(shí)間對水解率的影響

在溫度90℃、鹽酸濃度0.10mol/L、固液比1:25(g/mL)的條件下，考察水解時(shí)間對水解率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 水解時(shí)間對水解率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the yield of agar oligosaccharides

由圖4可見，在0～60min內(nèi)水解率呈直線上升趨勢，60～90min內(nèi)上升的趨勢趨于平緩，在水解90min時(shí)瓊膠的水解率達(dá)到58.75%，隨后水解率隨時(shí)間的延長變化很小，從能源的利用效率考慮，選取90min作為瓊膠水解的最適時(shí)間。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 模型的建立和方差分析

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken experimental design

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以3個(gè)主要因素，即鹽酸濃度、固液比和水解時(shí)間為自變量，以3次試驗(yàn)所得瓊膠水解率的平均值為響應(yīng)值(Y)設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2(15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)[16])。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design arrangement and experimental results

運(yùn)用Minitab數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件使用未編碼單位對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，回歸方程偏回歸系數(shù)估計(jì)值見表3。

表3 回歸方程偏回歸系數(shù)估計(jì)值Table 3 Estimated values of partial regression coefficients of the fitted regression model

由表3偏回歸系數(shù)估計(jì)值得鹽酸濃度(X1)、固液比(X2)、水解時(shí)間(X3)與水解率的二次多項(xiàng)回歸模型：

根據(jù)表3回歸模型方差分析，模型一次項(xiàng)X2、X3和平方項(xiàng)極顯著(P＜0.001)，X1項(xiàng)和交互項(xiàng)不顯著(P＞0.05)，可以看出各具體試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

進(jìn)一步對該回歸模型進(jìn)行方差分析，由表4可以看出，回歸模型具有顯著性(P＜0.05)，校正決定系數(shù)R2Adj=94.9%，說明響應(yīng)值(水解率)的變化有94.9%來源于所選變量，即鹽酸濃度、固液比和水解時(shí)間，失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05)。這表明，本試驗(yàn)所選取的因素與回歸方程的變量具有很好的回歸關(guān)系，試驗(yàn)因素對瓊膠水解率具有顯著關(guān)聯(lián)性，可以利用該模型來分析和預(yù)測瓊膠在這3種條件下的水解率。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted regression model

2.3.2 響應(yīng)曲面分析

圖5 Y=(X1, X2)的響應(yīng)面與等值線Fig.5 Response surface and contour plots of Y=(X1, X2)

圖6 Y=(X1, X3)的響應(yīng)面與等值線Fig.6 Response surface and contour plots of Y=(X1, X3)

圖7 Y=(X2, X3)的響應(yīng)面與等值線Fig.7 Response surface and contour plots of Y=(X2, X3)

為了觀察某兩個(gè)因素及其交互作用同時(shí)對水解率的影響，將其他因素條件保持不變，獲得某兩個(gè)因素及其交互作用對水解率影響的一元二次方程，就可以得到一組動(dòng)態(tài)的響應(yīng)曲面及其等值線圖，從而確定因素的最佳水平范圍，等值線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱趨勢[17]。分別固定變量鹽酸濃度(X1)、固液比(X2)和水解時(shí)間(X3)在原點(diǎn)，依次得到其他兩個(gè)變量的響應(yīng)面和等值線圖，由圖5～7的等值線圖可以看出，交互相的等值線圖近似圓形，表明交互相作用影響不顯著，這與表3中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致，從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等值線可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，即是響應(yīng)面的最高點(diǎn)。

2.3.3 確定最優(yōu)值和回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用SAS軟件的Rsreg程序進(jìn)行典型分析來確定各因素的最優(yōu)值[18]。通過分析后得到X1、X2、X3的編碼值分別為0.092345、0.230648、0.185462，與之換算得出相應(yīng)的實(shí)際值為鹽酸濃度X1=0.105mol/L、固液比X2=4.5:100(g/mL)、水解時(shí)間X3=95.6min，此時(shí)瓊膠水解率理論值Y=82.37%。考慮到實(shí)際操作的便利，將瓊膠水解條件的最佳工藝修正為鹽酸濃度0.105mol/L、固液比4.5:100(g/mL)、水解時(shí)間96min。在上述優(yōu)化條件下共進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示瓊膠水解率為(81.43±0.5)%，表明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化瓊膠的水解條件是可行的。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及在此基礎(chǔ)上三因素三水平響應(yīng)面法試驗(yàn)，建立了響應(yīng)值與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，依此模型可以預(yù)測瓊膠的理論水解率。依據(jù)此二次回歸模型，確定瓊膠水解的最佳工藝參數(shù)——鹽酸濃度0.105mol/L、固液比4.5:100(g/mL)、水解時(shí)間96min。按此工藝條件瓊膠水解率較高，水解率可達(dá)81.43%。建立的數(shù)學(xué)模型能很好預(yù)測各因素和水解率之間的關(guān)系。

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Optimization of Acid Hydrolysis of Agar by Response Surface Methodology

YANG Xian-qing1，LIU Gang1,2，QI Bo1，LI Lai-hao1，HAO Shu-xian1，DIAO Shi-qiang1
(1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China；2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Agar was subjected to acid hydrolysis and the content of agar oligosaccharides was determined by hydrochloric acid and phenol-sulfuric acid method. On the basis of single factor experiments, the hydrolysis procedure was optimized using response surface methodology, and a mathematical regression model (Y= 81.5933＋0.7175X1＋1.8938X2＋2.7313X3－3.1567X12－3.3042X22－3.3092X32－0.6625X1X2＋0.0475X1X3－0.8000X2X3) was established for predicting the yield of agar oligosaccharides (Y) at different levels of hydrochloric acid concentration (X1), hydrolysis time (X2), and solid/liquid ratio (X3).The optimal hydrolysis conditions were determined to be hydrochloric acid concentration of 0.105 mol/L, solid/liquid ratio of 4.5:100 (g/mL) and hydrolysis time of 96 min. The yield of agar oligosaccharides was up to 81.43% under the optimal hydrolysis conditions, which was in good agreement with the predicted value.

agar；acid hydrolysis；response surface methodology

TS244.1

A

1002-6630(2010)20-0173-05

2010-04-27

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z345)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903030-E)；

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)(A200899E01；A200901E02)；國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201005020)

楊賢慶(1963—)，男，研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工和質(zhì)量安全。E-mail：yxqgd@163.com