馮曉燕，周延政，孫文敬,，王大明，余泗蓮，劉敬澤,*

(1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050016；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221)

碘量法測(cè)定發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸

馮曉燕1，周延政2，孫文敬1,2，王大明1，余泗蓮3，劉敬澤1,*

(1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050016；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221)

在優(yōu)化樣品處理?xiàng)l件的基礎(chǔ)上，考察葡萄糖對(duì)2-酮基-D-葡萄糖酸測(cè)定的影響，改進(jìn)發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的碘量法測(cè)定技術(shù)。結(jié)果表明：滴定樣品溶液所消耗的I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積、樣品溶液中2-酮基-D-葡萄糖酸質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系，R2＞0.9999；該方法精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，2-酮基-D-葡萄糖酸的平均回收率為95.68%，RSD為1.35%(n=5)。該方法準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便，可用于發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的定量檢測(cè)。

2-酮基-D-葡萄糖酸；葡萄糖；發(fā)酵液；碘量法

2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)是目前國(guó)際上規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)的有機(jī)酸之一，主要作為食品抗氧化劑D-異抗壞血酸及其鹽類合成的前體[1-4]。關(guān)于發(fā)酵液中2KGA的測(cè)定方法已有一些報(bào)道，如旋光法[5]、酸堿滴定法[6]、HPLC法[1]、酶法[7]和碘量法[8-9]等。旋光法、HPLC法和酶法等儀器分析方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)發(fā)酵液中的2KGA，但因樣品處理過程復(fù)雜、所需儀器昂貴或試劑成本較高等原因而難以在國(guó)內(nèi)工業(yè)生產(chǎn)中得到推廣應(yīng)用；酸堿滴定法的操作過程比較簡(jiǎn)單，但因測(cè)定中的變色現(xiàn)象難以觀察而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果誤差較大。因此，碘量法成為目前國(guó)內(nèi)工業(yè)生產(chǎn)上檢測(cè)發(fā)酵液中2KGA的主要方法。

碘量法測(cè)定2KGA的基本原理：2KGA分子內(nèi)含有可直接發(fā)生酯化反應(yīng)的羧基和醇羥基，還含有可發(fā)生互變異構(gòu)反應(yīng)的羰基，在強(qiáng)酸性條件下加熱2KGA水溶液可以將其定量轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸[10]。利用D-異抗壞血酸與I2的氧化還原反應(yīng)可以定量測(cè)定D-異抗壞血酸的質(zhì)量濃度[11-12]，然后換算成2KGA的質(zhì)量濃度。該方法也稱轉(zhuǎn)化碘量法[13]。

長(zhǎng)期以來，國(guó)內(nèi)相關(guān)學(xué)者對(duì)發(fā)酵液中2KGA碘量法測(cè)定的準(zhǔn)確性還有一些質(zhì)疑。有學(xué)者認(rèn)為，發(fā)酵液中的葡萄糖對(duì)該法的測(cè)定結(jié)果影響很大[6]。因此，本研究對(duì)發(fā)酵液中2KGA的碘量法測(cè)定進(jìn)行方法學(xué)考察，為該方法在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2KGA發(fā)酵液：采用文獻(xiàn)[4]的菌種和方法自制；2KGA鈣鹽(2KGA含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78.41%) 江西省德興市百勤異V C鈉有限公司；葡萄糖、碘、碘化鉀、硫酸、氫氧化鈉、可溶性淀粉等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；?shí)驗(yàn)溶液均采用二次蒸餾水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

SBA-40型生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所；PHS-3C型pH計(jì) 上海精密儀器有限公司；AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；80-2型離心沉淀機(jī) 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；CS501型超級(jí)恒溫水浴器 常州諾基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備

取一定量的發(fā)酵液，4000r/min離心20min除去沉淀物。取1.0mL上清液于試管內(nèi)，與5.0mL 2.0mol/L H2SO4溶液充分混合，立刻將試管放入沸水浴中精確加熱35min。從水浴中取出試管后，立即用冷水將其冷卻，再用100mL蒸餾水將試管內(nèi)的反應(yīng)液洗入250mL三角瓶中，所得的混合液作為樣品溶液。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取各配比所需的無水葡萄糖和2KGA，用少量水將其充分溶解，加入100mL的容量瓶中定容。其他制備步驟同1.3.1節(jié)，所得的溶液作為對(duì)照品溶液1～9。

1.3.3 碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)定

按文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行配制和標(biāo)定。

1.3.4 葡萄糖的分析

25℃條件下，采用生物傳感分析儀測(cè)定。

1.3.5 pH值的測(cè)定

采用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.6 2KGA的測(cè)定

以1g/100mL的淀粉溶液為指示劑，用0.05mol/L的I2標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定待測(cè)溶液至藍(lán)色，30s內(nèi)溶液不褪色即為滴定終點(diǎn)，記錄滴定消耗的I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。待測(cè)溶液中2KGA的質(zhì)量濃度X1與I2標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗量Y之間存在如下關(guān)系：

式中：X1為待測(cè)樣品溶液中2KGA的質(zhì)量濃度/(mg/ mL)；Y為滴定待測(cè)樣品溶液時(shí)消耗的0.05mol/L I2標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；4.403為1.0mL 0.05mol/L I2標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于D-異抗壞血酸的毫克數(shù)[15-16]；A為測(cè)定條件下2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率；B為待測(cè)樣品溶液的取樣體積/mL；0.9071為D-異抗壞血酸與2KGA的相對(duì)分子質(zhì)量之比。

1.3.7 2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率測(cè)定

以特定條件對(duì)2KGA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后采用1.3.6節(jié)的方法測(cè)定反應(yīng)液消耗I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率(A)：

式中：V為滴定反應(yīng)液時(shí)消耗的0.05mol/L I2標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；4.403為1.0mL 0.05mol/L I2標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于D-異抗壞血酸的毫克數(shù)[15-16]；m為被測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液中2KGA的質(zhì)量/mg；0.9071為D-異抗壞血酸與2KGA的相對(duì)分子質(zhì)量之比。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 H2SO4用量的選擇

在水浴溫度100℃、加熱時(shí)間20min、H2SO4濃度2.0mol/L的條件下，對(duì)1.0mL質(zhì)量濃度為2.0g/100mL的2KGA溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，考察H2SO4用量對(duì)2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的影響。研究結(jié)果(表1)表明，H2SO4用量為5.0mL時(shí)，2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率最高。因此，選擇5.0mL的H2SO4用量作為2KGA樣品溶液的處理?xiàng)l件之一。

表1 H2SO4用量對(duì)2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的影響Table 1 Effect of H2SO4 concentration on the conversion reaction of 2KGA to D-isoascorbic acid

2.1.2 水浴溫度的選擇

表2 溫度對(duì)2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的影響Table 2 Effects of temperature on the conversion reaction of 2KGA to D-isoascorbic acid

在加熱時(shí)間為20min、被測(cè)樣品中加入5.0mL 2.0mol/L的H2SO4的條件下，對(duì)1.0mL質(zhì)量濃度為2.0g/100mL的2KGA溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，考察溫度對(duì)2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的影響。結(jié)果(表2)表明，轉(zhuǎn)化率隨水浴溫度的升高而提高；溫度達(dá)到100℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率有明顯的增加。因此，選擇100℃作為2KGA樣品溶液的處理溫度。

2.1.3 水浴時(shí)間的選擇

在水浴溫度100℃、被測(cè)樣品加入5.0mL 2.0mol/L H2SO4溶液的條件下，對(duì)1.0mL質(zhì)量濃度2.0g/100mL 2KGA溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，考察水浴時(shí)間對(duì)2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的影響(表3)。隨著水浴時(shí)間的增加，2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率呈增加趨勢(shì)，但反應(yīng)液的色澤也會(huì)逐漸加深。反應(yīng)時(shí)間超過35min時(shí)，轉(zhuǎn)化率的增加不再明顯(反應(yīng)接近平衡)，反應(yīng)液的色澤明顯變深。有學(xué)者認(rèn)為，反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致具有烯醇結(jié)構(gòu)的副產(chǎn)物產(chǎn)生，且該副產(chǎn)物同樣具有較強(qiáng)的還原性，會(huì)影響測(cè)定結(jié)果[10]。綜合考慮，該反應(yīng)的水浴時(shí)間以35min為宜，以避免過多副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

表3 水浴時(shí)間對(duì)2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的影響Table 3 Effects of water bath treatment time on the conversion reaction of 2KGA to D-isoascorbic acid

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 葡萄糖存在條件下碘量法測(cè)定2KGA的準(zhǔn)確性

根據(jù)2.1節(jié)研究結(jié)果可知，當(dāng)待測(cè)樣品中沒有葡萄糖存在時(shí)，在優(yōu)化的樣品處理?xiàng)l件下(即1.3.1節(jié)樣品溶液的制備條件)，待測(cè)樣品I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量Y與其2KGA質(zhì)量濃度X1之間存在的線性關(guān)系為Y= 0.0630004X1。該情況下碘量法測(cè)定的準(zhǔn)確性已經(jīng)得到實(shí)踐驗(yàn)證和相關(guān)學(xué)者的普遍認(rèn)可，在此不再進(jìn)行贅述。

按照國(guó)內(nèi)現(xiàn)行的測(cè)定方法，對(duì)對(duì)照品溶液中的2KGA質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)表明，葡萄糖對(duì)碘量法測(cè)定2KGA具有一定的影響，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，其相對(duì)誤差最高可達(dá)6.82%。利用Excel對(duì)對(duì)照品溶液I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗結(jié)果(表4)進(jìn)行多元線性回歸，可以得到線性回歸方程：Y=0.064060X1+0.000827X2，且R2＞0.9999。其中：Y為發(fā)酵液消耗碘液的體積(碘量值)/mL；X1為發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；X2為被測(cè)樣品中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

上述線性回歸方程的建立，說明滴定對(duì)照品溶液的I2標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗量、2KGA質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系，即葡萄糖對(duì)碘量法測(cè)定2KGA的影響可以從方法學(xué)上予以解決。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)表明，利用所建立的線性回歸方程計(jì)算對(duì)照品溶液中2KGA的質(zhì)量濃度，其相對(duì)誤差明顯降低。

表4 對(duì)照品溶液的組成及其碘量值測(cè)定結(jié)果Table 4 Composition and the iodine value of the standard solution

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)抽取對(duì)照品溶液5進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)(表5)。重復(fù)5次取樣測(cè)定的碘量值及葡萄糖質(zhì)量濃度的RSD值分別為0.49%和1.33%，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算的2KGA質(zhì)量濃度的RSD值為0.48%，說明該方法具有良好的精密度。

表5 碘量法測(cè)定2KGA的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Precisions of the iodometry for determining 2KGA content in the fermentation broth

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取新鮮的發(fā)酵液，4000r/min離心10min。將離心得到的上清液在25℃條件下分別放置0、30、60、90min和120min，再按照1.3.1節(jié)的方法對(duì)其進(jìn)行處理，然后測(cè)定樣品溶液的碘量值及葡萄糖質(zhì)量濃度，RSD值分別為0.79%和0.39%；根據(jù)所建立的線性回歸方程計(jì)算樣品溶液中2KGA的質(zhì)量濃度，RSD值為0.79%。結(jié)果(表6)表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，用于2KGA質(zhì)量濃度測(cè)定的樣品在2h內(nèi)穩(wěn)定。

表6 碘量法測(cè)定2KGA的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Stability of the iodometry for determining 2KGA content in the fermentation broth

2.2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取相同的發(fā)酵液5份，按1.3.1節(jié)方法分別進(jìn)行處理，測(cè)定所得各個(gè)樣品溶液的碘量值及葡萄糖質(zhì)量濃度，RSD值分別為0.55%和0.39%；根據(jù)所建立的線性回歸方程計(jì)算樣品溶液中2KGA的質(zhì)量濃度，RSD值為0.55%，結(jié)果(表7)表明重現(xiàn)性良好。

表7 碘量法測(cè)定2KGA的重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Reproducibility of the iodometry for determining 2KGA content in the fermentation broth

2.2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確量取2KGA質(zhì)量濃度36.6664mg/mL的發(fā)酵液50mL，精確加入0.6377g 2KGA鈣鹽(含2KGA 0.5000g)，按1.3.1節(jié)方法制備樣品溶液，平行5份。測(cè)定各個(gè)樣品溶液的碘量值及葡萄糖的質(zhì)量濃度，并根據(jù)所建立的線性回歸方程計(jì)算樣品溶液中2KGA的質(zhì)量濃度。計(jì)算結(jié)果(表8)顯示，2KGA的5次平均回收率為95.68%，RSD為1.35%。

表8 2KGA的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 8 Spike recoveries and RSD for determining 2KGA content in the fermentation broth

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品處理的適宜條件為2.0mol/L硫酸用量5.0mL，處理溫度100℃，處理時(shí)間35min。在葡萄糖存在的條件下，滴定樣品溶液的I2標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗量、樣品溶液中2KGA質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系，即葡萄糖對(duì)碘量法測(cè)定2KGA的影響可以從方法學(xué)上予以解決。2KGA碘量法測(cè)定技術(shù)的準(zhǔn)確度較高，精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速，適用于2KG A發(fā)酵過程的控制分析。

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Iodometric Determination of 2-Keto-D-gluconic Acid in Fermentation Broth

FENG Xiao-yan1，ZHOU Yan-zheng2，SUN Wen-jing1,2，WANG Da-ming1，YU Si-lian3，LIU Jing-ze1,*
(1. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China；2. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；3. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China)

Iodometric method was improved to prevent the interference of glucose in determination of 2-keto-D-gluconic acid (2KGA) in fermentation broth. The results revealed a good linear relationship among the volumes of I2 standard solution consumed and concentrations of 2-keto-D-gluconic acid and glucose (R2＞0.9999). The average recovery was 95.68% with the relative standard deviation (RSD) of 1.35% (n=5). The method developed here had good accuracy, stability and reproducibility, and was easily operated, hereby could be used for the determination of concentrations of 2-keto-D-gluconic acid in fermentation broth.

2-keto-D-gluconic acid；glucose；fermentation broth；iodometry

TQ921.2

A

1002-6630(2010)24-0314-04

2010-08-29

江蘇大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(08JDG029)；江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2008DD00600)；江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(贛財(cái)教[2008]147號(hào))

馮曉燕(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锷鷳B(tài)學(xué)。E-mail：xiaoyan0316@126.com

*通信作者：劉敬澤(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)學(xué)。E-mail：liujingze@mail.hebtu.edu.cn