惠豐立，褚學(xué)英，柯 濤，張彩瑩

(南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽 473061)

促進(jìn)酵母菌乙醇發(fā)酵新方法

惠豐立，褚學(xué)英，柯 濤，張彩瑩

(南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽 473061)

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加固態(tài)基質(zhì)，研究不同固態(tài)基質(zhì)對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵的促進(jìn)作用。結(jié)果表明：在培養(yǎng)基中分別添加2g/100mL的麥秸桿、花生殼、稻殼和鋸末，可使發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度提高了15.5%～24.8%。在4種不同固態(tài)基質(zhì)中，稻殼對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵的促進(jìn)作用最顯著。以稻殼作為固態(tài)基質(zhì)，確定了添加固態(tài)基質(zhì)條件下酵母菌乙醇發(fā)酵的最適條件為：稻殼2.5g/100mL、初糖12g/100mL、溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間48h。在適宜的發(fā)酵條件下，發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度可達(dá)到51.8g/L，為理論產(chǎn)率的92.7%。

酵母菌；乙醇發(fā)酵；固態(tài)基質(zhì)；稻殼

以生物質(zhì)資源為原料，發(fā)酵法生產(chǎn)的燃料乙醇作為可再生清潔能源，對(duì)于緩解當(dāng)前石油資源嚴(yán)重短缺及生態(tài)環(huán)境惡化的雙重危機(jī)具有十分重要的意義。然而，現(xiàn)有的乙醇發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)中，原料的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的得率都較低，高昂的生產(chǎn)成本嚴(yán)重制約了燃料乙醇工業(yè)的發(fā)展[1-2]。因此，對(duì)傳統(tǒng)乙醇發(fā)酵工藝進(jìn)行改造，開發(fā)低成本乙醇生產(chǎn)新技術(shù)，以適應(yīng)燃料乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要顯得尤為迫切。

近年來，高轉(zhuǎn)化率、低成本的乙醇發(fā)酵新技術(shù)已受到國內(nèi)外有關(guān)研究者的關(guān)注。現(xiàn)已證實(shí)在培養(yǎng)基中添加脂蛋白[3]、幾丁質(zhì)[4]、肌醇[1]、營養(yǎng)鹽[5]、氮類營養(yǎng)物[6-8]、滲透壓保護(hù)劑[9]、吐溫-80和麥角甾醇[10]，采用工程菌株[11]、固定化細(xì)胞[12-13]等方法，能不同程度的提高原料轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的得率，但這些方法在一定程度上又增加了生產(chǎn)成本。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)既能提高乙醇的產(chǎn)量又能降低生產(chǎn)成本的添加物中，固態(tài)基質(zhì)更加具有可行性。本實(shí)驗(yàn)以廉價(jià)的農(nóng)林廢棄物作為酵母菌乙醇發(fā)酵的固態(tài)基質(zhì)，探討不同固態(tài)基質(zhì)對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵的影響，建立一種高轉(zhuǎn)化率、低成本的乙醇發(fā)酵新方法，為促進(jìn)燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，緩解當(dāng)前石油資源嚴(yán)重短缺提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)dqy-1由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/100mL)：葡萄糖2、酵母粉0.3、蛋白胨0.5、瓊脂粉1.5；種子培養(yǎng)基(g/100mL)：葡萄糖2、酵母粉0.3、蛋白胨0.5；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100mL)：葡萄糖6～14、酵母粉0.3、蛋白胨0.5。

1.1.3 固態(tài)基質(zhì)

選用麥秸桿、花生殼、稻殼和鋸末，顆粒大小如稻殼。

1.1.4 儀器與設(shè)備

HMY200型全溫度恒溫培養(yǎng)搖床、ZSD-1160型生化培養(yǎng)箱 上海智誠公司；HM-12P型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；UNIVERSAL 320R型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國Hettich公司；SBA-40 C型生物傳感分析儀 山東省生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 種子制備

從剛轉(zhuǎn)接好的新鮮斜面上挑取一環(huán)菌種，接入種子培養(yǎng)基中(裝液量50mL)，置于搖床上在28℃、160r/min振蕩培養(yǎng)18～24h。

1.2.2 發(fā)酵方法

按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(裝液量為100mL)，置于培養(yǎng)箱中28℃發(fā)酵40h(在對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，根據(jù)具體情況設(shè)定)。

1.2.3 分析方法

乙醇及葡萄糖含量的測(cè)定均采用SBA-40 C型生物傳感分析儀。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同固態(tài)基質(zhì)對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加2g/100mL的麥秸桿、花生殼、稻殼和鋸末，發(fā)酵40h后，測(cè)定發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度，結(jié)果見表1。

表1 不同固態(tài)基質(zhì)對(duì)乙醇發(fā)酵的影響Table 1 Effect of solid matrix type on ethanol fermentation by S. cerevisiae

由表1可知，在培養(yǎng)基中分別添加4種不同的固態(tài)基質(zhì)，發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度提高了15.5%～24.8%。其中添加稻殼的發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度最高，比未添加固體基質(zhì)的發(fā)酵液提高了24.8%。這說明在培養(yǎng)基中添加不同的固態(tài)基質(zhì)對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵均有明顯的促進(jìn)作用。在4種不同的固態(tài)基質(zhì)中，稻殼是最適宜的添加物。

2.2 固態(tài)基質(zhì)不同添加量對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵的影響

以稻殼為固態(tài)基質(zhì)，研究其不同添加量對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵的影響，結(jié)果如表2所示。在培養(yǎng)基中分別添加1～3g/100mL的稻殼，發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度均有不同程度提高，其中添加2.5g/100mL稻殼的發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度比未添加稻殼的發(fā)酵液增加了27.9%。由此可以確定稻殼的最適添加量為2.5g/100mL。

表2 固態(tài)基質(zhì)(稻殼)不同添加量對(duì)乙醇發(fā)酵的影響Table 2 Effect of rice hull amount on ethanol fermentation by S. cerevisiae

2.3 不同初糖質(zhì)量濃度條件下固態(tài)基質(zhì)對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵的影響

為研究不同初糖質(zhì)量濃度條件下固體基質(zhì)對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵的影響，在含有6～14g/100mL初糖質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中分別添加2.5g/100mL稻殼，結(jié)果如圖1所示。

圖1 初糖質(zhì)量濃度對(duì)乙醇發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of initial glucose concentration on ethanol fermentation by S. cerevisiae

由圖1可知，在培養(yǎng)基中添加固態(tài)基質(zhì)均能提高乙醇質(zhì)量濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中初糖質(zhì)量濃度為12g/100mL時(shí)，發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到了最大值，比對(duì)照提高了24.8%。

2.4 不同溫度條件下固態(tài)基質(zhì)對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵的影響在發(fā)酵培養(yǎng)基添加2.5g/100mL稻殼，將初糖質(zhì)量濃度調(diào)到12g/100mL，研究不同溫度條件下固態(tài)基質(zhì)對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對(duì)乙醇發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on ethanol fermentation by S. cerevisiae

由圖2知，在28～36℃范圍內(nèi)，在培養(yǎng)基中添加固態(tài)基質(zhì)均能提高乙醇質(zhì)量濃度。當(dāng)發(fā)酵溫度升高到30℃時(shí)，乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，比對(duì)照提高了28.6%。2.5 添加固態(tài)基質(zhì)條件下的酵母菌乙醇發(fā)酵過程

圖3 添加固態(tài)基質(zhì)條件下乙醇發(fā)酵過程Fig.3 Time course of ethanol fermentation with the addition of rice hull to the medium

圖3為添加固態(tài)基質(zhì)條件下(稻殼2.5g/100mL、初糖濃度12g/100mL、溫度30℃)酵母菌乙醇發(fā)酵過程。在0～48h內(nèi)發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。當(dāng)發(fā)酵48h時(shí)，發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到了最大值，隨后漸趨于穩(wěn)定并有下降的趨勢(shì)。發(fā)酵液中葡萄糖含量則隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少，最后趨于0。由此可見，在添加固態(tài)基質(zhì)條件下，酵母菌乙醇發(fā)酵的最適時(shí)間是48h，此時(shí)乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到51.8g/L，為理論產(chǎn)率的92.7%。

3 討 論

在傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵過程中，酒精發(fā)酵濃度低，原料的利用率和酒精的轉(zhuǎn)化率也低，能量消耗大，導(dǎo)致生產(chǎn)效率較差。對(duì)傳統(tǒng)乙醇發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行改造，開發(fā)低成本乙醇生產(chǎn)新技術(shù)，受到國內(nèi)外有關(guān)研究者的高度重視。通過在培養(yǎng)基中添加營養(yǎng)鹽、氮源及其營養(yǎng)物能改善酵母生長(zhǎng)環(huán)境，縮短發(fā)酵周期，提高酒精產(chǎn)量[5-8]。在高濃度酒精發(fā)酵條件下，加入滲透壓保護(hù)劑，有助于增加酒精產(chǎn)量，提高糖利用率[9]。添加吐溫-80和麥角甾醇的高濃度酒精發(fā)酵，最終酒精體積分?jǐn)?shù)可以達(dá)15.32%[10]。采用工程菌株、固定化細(xì)胞等方法，能不同程度的提高原料轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的得率[11-13]。但這些方法由于在不同程度上增加了生產(chǎn)成本，對(duì)于大宗低值燃料的乙醇難于在工業(yè)上推廣應(yīng)用。

本研究在培養(yǎng)基中添加不同的農(nóng)林廢棄物作為酵母菌乙醇發(fā)酵的固態(tài)基質(zhì)，對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵均有明顯的促進(jìn)作用。在4種不同固態(tài)基質(zhì)中，稻殼對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵的促進(jìn)作用最顯著。固態(tài)基質(zhì)的添加能有效改變酵母菌的代謝環(huán)境，為其發(fā)酵作用提供了有利的場(chǎng)所，從而提高原料轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的得率，具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、高效等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)乙醇發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的參考價(jià)值。

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A Novel Method for Enhancing Ethanol Fermentation by Saccharomyces cerevisiae

HUI Feng-li，CHU Xue-ying，KE Tao，ZHANG Cai-ying
(College of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China)

Solid matrix was added to fermentation medium for exploring the effect of solid matrix on ethanol fermentation in yeast cells. Results indicated that the addition of 2 g of straw, peanut hull, rice hull or wood shavings to 100 mL medium could improve ethanol production by 15.5%－24.8%. Rice hull was the most suitable solid matrix and the optimal technological parameters for rice hull were found to be: rice hull amount 2.5 g/100 mL; initial glucose concentration 12 g/100 mL; fermentation temperature 30 ℃, and fermentation time 48 h. Under these optimal conditions, the actual production of alcohol reached up to 51.8 g/L, which was 92.7% of the theoretical value.

yeast；ethanol fermentation；solid matrix；rice hull

S216.2

A

1002-6630(2010)19-0292-03

2010-02-28

河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(092102110120)；河南省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009A180012)

惠豐立(1965—)，男，教授，碩士，主要從事生物質(zhì)能利用研究。E-mail：huifl@126.com