于化泓，李湘梅，劉 蓉，鄧澤元*，李 靜，范亞葦，胡蔣寧

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

反油酸對人臍靜脈內皮細胞活力的影響

于化泓，李湘梅，劉 蓉，鄧澤元*，李 靜，范亞葦，胡蔣寧

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

目的：觀察反油酸對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖活力的影響。方法：采用50、100、200、400、600μmol/L等5個濃度的反油酸作用于人臍靜脈內皮細胞，以正常組為陰性對照組，NaOH組(200μmol/L)為陽性對照組，MTT法和臺盼藍排斥實驗檢測其對內皮細胞的毒性。結果顯示：反油酸組內皮細胞增殖活力明顯低于正常組，且高濃度組(400、600μmol/L)對細胞增殖抑制率明顯高于低濃度組(50μmol/L)；而NaOH組與正常組比較卻無明顯差異。此外，反油酸組活細胞率降低。結論：反油酸對內皮細胞有明顯毒副作用，其生長抑制率與反油酸濃度和作用時間呈正相關。

反油酸；人臍靜脈內皮細胞；MTT法

心血管疾病是在全世界死亡率和發(fā)病率較高的一種疾病?！?002年世界衛(wèi)生報告》指出，全球每年因心血管病死亡約1700萬人[1]。在我國，肥胖和高血壓人口達2億6千萬，每年有250萬人死于心腦血管疾病，尤其是動脈粥樣硬化。我國居民攝食油脂含量較高，遠超過了營養(yǎng)學會推薦的水平。氫化油作為食品加工中常用的油脂，其中反式脂肪酸(TFA)的含量較高[2]。研究表明，反式脂肪酸對心血管疾病特別是動脈粥樣硬化的發(fā)生呈正相關[3]。目前有關反式脂肪酸的研究主要集中在其對血液成分的影響和對心血管疾病的關系?，F有學者報道反式脂肪酸引起心血管疾病部分是因為其會誘發(fā)內皮細胞的凋亡[4]。觀測研究與隨機對比臨床實驗均表明TFA的攝入能引起內皮功能障礙和系統(tǒng)炎癥，且這一影響遠大于對血脂的影響，但具體機制還有待深入研究[5]。因此，從內皮細胞這一新的角度深入認識反式脂肪酸引起心血管疾病的發(fā)病機理，有利于更為透徹地了解心血管疾病，為我國心血管疾病的防治提供科學依據。本研究采用MTT法和臺盼藍排斥實驗研究反油酸對人臍靜脈內皮細胞活力的影響，進而了解其對內皮細胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

人臍靜脈內皮細胞 江西醫(yī)學院；反油酸標準品Sigma公司；初生牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM Invitrogen 公司；PBS 北京中杉金橋生物技術有限公司；谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、MTT、臺盼藍 Solarbio公司；EDTA、重鉻酸鉀、硫酸、DMSO 天津大茂公司。

CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、倒置顯微鏡、MK3型酶標儀 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內皮細胞的培養(yǎng)

用含10%初生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞。

1.2.2 細胞毒性實驗[6]

1.2.2.1 不同密度細胞對反油酸作用反應靈敏性的比較

取對數生長期的人臍靜脈內皮細胞，調整細胞為1×104、1.5 × l04、2 × 104、2.5 × 104、4 × 104個 /mL 5個濃度，以100μL/孔接種于96孔板中，每個濃度設6個復孔，種兩板，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待細胞貼壁生長穩(wěn)定后，其中一板為正常組，另一板加入反油酸，濃度為20μmol/L，作用24h后，用MTT法于570nm波長處測定光密度值(OD570nm)。重復3次。計算內皮細胞生長的抑制率。

抑制率/%= (1－實驗組OD570nm/正常組OD570nm)×100

1.2.2.2 MTT法測定不同濃度反油酸對細胞活力的影響

將80%融合生長的人臍靜脈內皮細胞以胰蛋白酶消化后以2.5×104個/ mL的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液，換用含5%初生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，以9:1的比例加入不同濃度的反油酸母液，使其終濃度為50、100、200、400、600μmol/L，其中反油酸母液以0.1mol/L NaOH促溶，使NaOH在實驗組中的濃度為200μmol/L，每組6個復孔，以正常組為陰性對照組，NaOH組(200μmol/L)為陽性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后，移出培養(yǎng)液，換入無血清DMEM培養(yǎng)液180μL/孔，并于每孔加入MTT(5g/L)20μL。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔中加入DMSO 150μL，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解，并用酶聯免疫檢測儀于570nm波長處檢測光密度值(OD570nm)，計算各濃度反油酸對細胞抑制率的影響。

1.2.3 臺盼藍排斥實驗[7]

將80%融合生長的人臍靜脈內皮細胞以胰蛋白酶消化后以5×104個/mL的密度接種于100mL的培養(yǎng)瓶中，每瓶5mL，每個濃度重復3次。培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液，分別加入含0、50、1 00、2 00、400、600 μmol/L的DMEM培養(yǎng)液(5%初生牛血清)，繼續(xù)培養(yǎng)48h。PBS沖洗細胞，0.25%的胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，并作適當稀釋(106個/mL)。取5滴細胞懸液于小試管中，加入5滴0.4%臺盼藍溶液混勻。在3min中內用血球計數板分別計數活細胞和死細胞(死細胞呈藍色)，并計算活細胞率。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 不同密度細胞對反油酸反應靈敏性的比較

不同密度內皮細胞對反油酸作用反應靈敏性不同，其對細胞OD570nm的影響見表1。反油酸對細胞抑制率的大小與細胞接種密度存在一定關系，當接種細胞密度為2.5×104個/ mL時，反油酸的抑制作用最強。因此這一濃度為人臍靜脈內皮細胞毒理實驗的較好濃度。

2.2 不同濃度和作用時間下反油酸對細胞生長活力的影響

由表2可見，反油酸組與正常組相比，OD570nm顯著減少(P＜0.05)，且各濃度組間，50與400、600μmol/L組存在明顯差異，而NaOH組與正常組無明顯差異。此外，反油酸對細胞生長的抑制率亦受時間的影響，在作用24h后，只有高濃度組的反油酸(400、600μmol/L)與NaOH組存在明顯差異，但當作用時間增至48h時，反油酸組均與NaOH組存在顯著差異，且細胞的生長抑制率隨時間的延長而增大?？梢姺从退嵩谏鲜鰟┝糠秶?50～600μmol/L)內對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞增殖具有明顯的抑制作用，且與作用時間和濃度呈正相關。

表1 反油酸對不同密度細胞OD570nm的影響(±s)Table 1 Effect of oleic acid on OD values at 570 nm of different density HUVEC cell suspensions (±s)

表1 反油酸對不同密度細胞OD570nm的影響(±s)Table 1 Effect of oleic acid on OD values at 570 nm of different density HUVEC cell suspensions (±s)

注：*.與正常組比較， 差異顯著(P＜0.05)。

組別 OD570nm 1×104個/mL 1.5×104個/mL 2×104個/mL 2.5×104個/mL 4×104個/mL正常組 0.119±0.012 0.166±0.016 0.191±0.013 0.237±0.011 0.258±0.016反油酸組 0.098±0.010* 0.124±0.010* 0.141±0.017* 0.158±0.016* 0.215±0.019*

表2 不同濃度和不同作用時間下反油酸對細胞生長的抑制率±s)Table 2 Effect of oleic acid concentration and treatment time on the inhibition rate on HUVEC cell proliferation±s)

表2 不同濃度和不同作用時間下反油酸對細胞生長的抑制率±s)Table 2 Effect of oleic acid concentration and treatment time on the inhibition rate on HUVEC cell proliferation±s)

注：*.與正常組比較，差異顯著(P＜0.05)；★.與反油酸50μmol/L組比較，差異顯著(P＜0.05)；▲.與NaOH組比較，差異顯著(P＜0.05)。

組別 反油酸濃 OD570nm 抑制率/%度/(μmol/L) 24h 48h 24h 48h正常組 0 0.242±0.015 0.326±0.021 — —1組 50 0.217±0.012* 0.291±0.018*▲ 10.33 10.74 2組 100 0.213±0.007* 0.285±0.010*▲ 11.98 12.58 3組 200 0.213±0.011* 0.277±0.019*▲ 11.98 15.03 4組 400 0.208±0.009*★▲ 0.254±0.017*★▲ 14.05 22.09 5組 600 0.205±0.013*★▲ 0.228±0.016*★▲ 15.29 30.06 NaOH組 0 0.228±0.016 0.315±0.017 — —

2.3 臺盼藍排斥實驗

臺盼藍染色后，發(fā)現反油酸組有藍染的死亡細胞，而正常組沒出現。血球計數板計數活細胞和死細胞，并計算活細胞率，結果如圖1所示。

圖1 反油酸作用48h對人臍靜脈內皮細胞活細胞率的影響Fig.1 Effect of oleic acid concentration on viability of HUVEC cells after oleic acid treatment for 48 h

由圖1可知，各組隨反油酸濃度的增加細胞存活率降低，各濃度反油酸組與正常組有顯著差異，低濃度反油酸組(50μmol/L)與高濃度組(400、600μmol/L)有明顯差異(P＜0.05)。當反油酸濃度增至600μmol/L時，活細胞率降至72.6%，死亡細胞數明顯增加?？梢?，反油酸對人臍靜脈內皮細胞具有明顯的損傷作用，促進了細胞凋亡。

3 討 論

在日常生活中，人們攝食的反式脂肪酸大部分來源于部分氫化植物油，但研究表明反式脂肪酸對人體健康具有不良影響，特別是對心血管健康的威脅[8]。TFA對心血管疾病的不良作用研究大多集中在脂質效應[9]，近年發(fā)現TFA還引起非脂質損傷，如促進炎癥反應的進程[10]、加重胰島素抑制[11]、引起內皮細胞損傷[12]。有學者研究發(fā)現TFA的攝入增加了腫瘤壞死因子(TNF)的活性，在調整所引起的異常血脂的水平后，這一影響只減少了25%?？梢?，TFA對內皮細胞損傷的影響比血脂要重要的多[13]。本研究亦發(fā)現反油酸對人臍靜脈內皮細胞正常增殖具有明顯的抑制作用，且隨時間的延長，抑制作用越明顯，當反油酸濃度在50μmol/和600μmol/L之間時，抑制作用與藥物濃度亦呈正相關，反油酸濃度達到600μmol/L時，抑制率可達到30%(作用48h)。此外，反油酸能明顯增加內皮細胞死亡的數目，這些均表明TFA對其具有明顯的毒副作用，能引起內皮細胞損傷。血管內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)形成的始動環(huán)節(jié)。血管內皮細胞是所有心血管風險因子共同的靶點，Esper等[14]發(fā)現內皮細胞能釋放很多具有雙向功能的分子，以抵消血管內各種物理和化學刺激，維持體內平衡。當內皮細胞受損時，會失去維持細胞平衡的能力，導致各種脂質和白細胞侵入內皮，激發(fā)炎癥反應，形成脂質條紋，進而發(fā)展成動脈斑塊。而在這一過程中，內皮細胞通透性的增加是脂質侵入最早的病理變化[15]。在Kummerow等[16]的研究中，發(fā)現反油酸能引起內皮細胞膜的紊亂。此外，內皮功能障礙可致血管收縮異常，血小板黏附、聚集、血栓形成及平滑肌細胞(VSMC) 增殖，因此血管內皮功能障礙對冠狀動脈疾病的發(fā)生、發(fā)展起著始動和促進作用[17]。因此TFA對內皮細胞的影響應引起足夠重視，但其具體影響機制需進一步深入研究。

[1] 胡大一. 警惕中國心腦血管疾病第二次浪潮[J]. 醫(yī)學研究雜志, 2007,36(3): 7-8.

[2] REMIG V, FRANKLIN B, MARGOLIS S, et al. Trans fats in America:a review of their use, consumption, health implications, and regulation[J]. Journal of American Dietetic Association, 2009, 110: 585-592.

[3] SHERAZI S T H, KANDHRO A, MAHESARA S A, et al. Application of transmission FT-IR spectroscopy for the trans fat determination in the industrially processed edible oils[J]. Food Chemistry, 2009, 114: 323-327.

[4] ZAPOLSKA-DOWNAR D, KOMIDER A, NARUSZEWICZ M. Trans fatty acid induce apoptosis in human endothelial cells[J]. Journal of Physiology and Pharmacology, 2005, 56(4): 611-625.

[5] LOPEZ-GARCIA E, SCHULZE M B, MEIGS J B, et al. Consumption of trans fatty acids is related to plasma biomarkers of inflammation and endothelial dysfunction[J]. Nutritional Epidemiology, 2005, 135: 562-566.

[6] 王遠航, 黃文權. MTT法檢測蒲黃提取物對臍靜脈內皮細胞增殖的影響[J]. 世界中西醫(yī)結合雜志, 2009(8): 547-552.

[7] 李程. 骨靶向抗骨質疏松藥物:依替二膦酸鍶的合成及藥效研究[D].四川: 四川大學, 2007.

[8] 劉小如, 鄧澤元, 李靜. 氫化植物油中的反式脂肪酸及其對妊娠哺乳期母嬰的影響[J]. 中國乳品工業(yè), 2007, 35(12): 29-34.

[9] BROUWER I A, WANDERS A J, KATAN M B. Effect of animal and industrial trans fatty acids on HDL and LDL cholesterol levels in humans:a quantitative review[J]. PloS One, 2010, 5(3): 1-10.

[10] WALLACE S K, MOZAFFARIAN D. Trans-fatty acids and nonlipid risk factors[J]. Current Atherosclerosis Reports, 2009, 11(6): 423-433.[11] MICHA R, MOZAFFARIAN D. Trans fatty acids: Effects on cardiometabolic health and implications for policy[J]. Prostaglandings,Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 2008, 79: 147-152.

[12] MOZAFFARIAN D, ARO A, WILLETT W C. Health effects of transfatty acids: experimental and observational evidence[J]. European Journal of Clinical Nutrition, 2009, 63(Suppl 2): 5-21.

[13] MOZAFFARIAN D. Trans fatty acids-effects on systemic inflammation and endothelial function[J]. Atherosclerosis Supplements, 2006, 7: 29-32.

[14] ESPER R, VILARINO J, MACHADO A, et al. Endothelial dysfunction in normal and abnormal glucose metabolism[J]. Cardiovascular Diabetology: Clinical, Metabolic and Inflammatory Facets, 2008, 45:17-43.

[15] BOOS C J, BLANN A D, LIP G Y. Assessment of endothelial damage/dysfunction: a focus on circulating endothelial cells[J]. Methods in Molecular Medicine, 2008, 139: 211-224.

[16] KUMMEROW F A, ZHOU Q, MAHFOUZ M M. Effect of trans fatty acids on calcium influx into human arterial endothelial cells[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 1999, 70(5): 832-838.

[17] 張均華. 血管內皮功能障礙與冠狀動脈疾病[J]. 中華老年心腦血管病, 2002(4): 3.

Effect of Oleic Acid on Proliferation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells

YU Hua-hong，LI Xiang-mei，LIU Rong，DENG Ze-yuan*，LI Jing，FAN Ya-wei，HU Jiang-ning
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To observe the effect of oleic acid on the proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods: HUVECs were treated with oleic acid at concentrations of 50, 100, 200, 400μ mol/L and 600 μ mol/L (in combination with NaOH at a final concentration of 200 μmol/L), respectively. The normal group receiving no treatment was served as the negative control, and the groups treated with NaOH at 200μmol/L alone were used as the positive control. MTT assay and trypan blue exclusion tests were used to evaluate the toxicity of oleic acid on cells. Results: Compared with the normal group, oleic acid significantly inhibited the proliferation of HUVECs. In addition, compared with the group treated with oleic acid at a low concentration (50μ mol/L), an obvious strong inhibition effect on cell proliferation was observed in groups treated with oleic acid at high concentrations (400 μmol/L and 600 μmol/L). However, no significant difference was observed between the positive control and the normal group. Moreover, the amount of viable cells in oleic acid-treated groups was obviously reduced.Conclusion: Oleic acid has obvious side effect on HUVECs in a concentration- and time-dependent manner.

oleic acid；human umbilical vein endothelial cells；MTT assay

O547

A

1002-6630(2010)19-0372-03

2010-06-30

國家自然科學基金項目(30972482)；江西省學術帶頭人計劃項目(2008DD00900)；教育部博士點基金項目(20070403002)；江西省青年科學基金項目(2008GQY0023)

于化泓(1964—)，女，博士研究生，研究方向為營養(yǎng)與人體健康。E-mail：yhh917@163.com

鄧澤元(1963—)，男，教授，博士，研究方向為脂肪酸及天然產物與人體健康。E-mail：dengzy28@yahoo.com.cn