謝 易,劉廣義,韓 飛,姜 虹,茅幼英,王慧萍,趙 杰,金 娟,陳江華

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腎臟病中心,國家中醫(yī)藥管理局三級實(shí)驗(yàn)室“腎臟病免疫實(shí)驗(yàn)室”,浙江杭州 310003)

靶向造影劑(Gd-DTPA-Granzyme B)的制備

謝 易,劉廣義,韓 飛,姜 虹,茅幼英,王慧萍,趙 杰,金 娟,陳江華

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腎臟病中心,國家中醫(yī)藥管理局三級實(shí)驗(yàn)室“腎臟病免疫實(shí)驗(yàn)室”,浙江杭州 310003)

目的：探討以顆粒酶 B為靶向的磁共振造影劑 (gadolinium-diethylenetriaminepentaaceticgranzyme B monoclonal antibody,Gd-DTPA-GB mAb)的制備方法及反應(yīng)條件。方法：采用顆粒酶 B單抗制成顆粒酶 B靶向造影劑 Gd-DTPA-GB mAb;通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flightmass spectrometry,MALD I-TOF-MS)計(jì)算其相關(guān)參數(shù),采用MTT法檢測其細(xì)胞毒性,以及免疫組化法判定其免疫活性。結(jié)果：MALD I-TOF-MS鑒定結(jié)果顯示：顆粒酶B單抗的質(zhì)荷比高峰主要出現(xiàn)在 133986.41處,連接 Gd-DTPA后高峰主要在139736.06的位置;根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果計(jì)算得每分子抗體可以連接 20個(gè)左右的 Gd3+;MTT法結(jié)果顯示：Gd、DTPA、Gd-DTPA,以及 Gd-DTPA-GB mAb組在濃度逐漸遞增的情況下對于細(xì)胞活性沒有明顯影響,且 4組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);免疫組化結(jié)果顯示：靶向造影劑 (1∶175)與陽性對照組 (1∶150)比較,具有較高的免疫活性。結(jié)論：在體外,本實(shí)驗(yàn)室設(shè)定的條件能夠合成磁共振靶向造影劑 Gd-DTPA-GB mAb,而且該造影劑具有良好的免疫活性,無明顯細(xì)胞毒性。

磁共振成像;三胺五乙酸;釓 DTPA;造影劑;釓;光譜法,質(zhì)量,基質(zhì)輔助激光解吸電離

[J ZhejiangUniv(Medical Sci),2010,39(3)：290-295.]

靶向磁共振技術(shù)是近年來產(chǎn)生的新型磁共振成像技術(shù),主要有兩類,一類是以釓 (Gd)為基礎(chǔ)的順磁性分子探針,能產(chǎn)生 T1陽性信號對比,有鑭螯合劑和 Gd-DTPA及其衍生物;另一類為利用氧化鐵的超順磁性分子探針,能產(chǎn)生強(qiáng)烈的 T2陰性信號對比,可以是單晶體,也可以是涂有多糖的多晶體。其中以 Gd為基礎(chǔ)的造影劑主要利用 Gd-DTPA與特異性載體分子如單克隆抗體結(jié)合,在后者的引導(dǎo)下,造影劑可以在該載體分子靶向的器官,機(jī)體某部位或疾病組織特異性濃聚,改變組織中周圍水分子的 T1弛豫時(shí)間,從而形成特異性磁共振圖像。同時(shí),結(jié)合了載體分子的造影劑也可以增加造影劑在組織中的保留時(shí)間,延長增強(qiáng)效果[1-3]。Kurin[4]等將結(jié)腸癌細(xì)胞 (W iDr細(xì)胞)種植于裸鼠體表造成腫瘤模型,向其注射與單克隆抗體(針對W iDr細(xì)胞)結(jié)合的磁共振造影劑,可造成造影劑在腫瘤組織濃聚,清除時(shí)間明顯延長。Boutry[5]等發(fā)現(xiàn)在大鼠暴發(fā)性肝炎模型中,以炎癥介質(zhì) E-選擇素為靶向的磁共振造影劑 Gd-DTPA-B(s Lex)A可以在病變肝臟組織中濃聚,相比于常規(guī)造影劑增強(qiáng)MRI,前者的強(qiáng)化效果更加明顯,持續(xù)時(shí)間更長。與傳統(tǒng)磁共振成像比較,靶向磁共振具備了較高的敏感性,同時(shí)新合成的靶向造影劑也能夠克服非特異性造影劑的應(yīng)用局限,對于疾病的早期診斷有一定的價(jià)值。目前磁共振靶向造影劑不僅在腫瘤靶向方面[6-7]比較熱門,在炎癥、血管等方面也有許多研究。

眾所周知移植排斥反應(yīng)具有明顯的免疫反應(yīng)激活與炎癥細(xì)胞浸潤過程,其中也涉及了許多免疫相關(guān)分子的特異性表達(dá)[8-9]。顆粒酶 B(Granzyme B)是細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞的主要效應(yīng)分子,在急性排斥反應(yīng)中,活化后的 T淋巴細(xì)胞釋放顆粒酶 B進(jìn)入靶細(xì)胞,激活核酸內(nèi)切酶系統(tǒng),使靶細(xì)胞 DNA斷裂,引起靶細(xì)胞凋亡。Zhang[10]等發(fā)現(xiàn)在大鼠移植模型中,TCRα β+CD3+CD4

-CD8-T細(xì)胞主要通過穿孔素 /顆粒酶 B機(jī)制調(diào)控 T、B細(xì)胞反應(yīng),提示穿孔素 /顆粒酶B在大鼠移植物排斥中也起著重要作用。本中心的研究[11]也發(fā)現(xiàn),移植腎急性排斥患者尿中穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)上調(diào),提示顆粒酶B對于移植腎排斥的早期診斷有一定的臨床價(jià)值。為此,本研究利用抗顆粒酶 B單抗與 Gd-DTPA偶聯(lián),探討其合成的最佳條件,以期合成一種新型磁共振造影劑,為移植腎急性排斥反應(yīng)的研究建立更具特異性的早期無創(chuàng)診斷方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DTPABA(Sigma公司,美國),二甲基酰胺 (上海生工,中國),顆粒酶 B單克隆抗體 (SPR ING公司,美國),GdCl3(上海生

工,中國 ),PD-10柱 (Amersham公司,美國 ),ABC三步法免疫組化檢測試劑盒 (Vector Laboratories公司,美國),羊抗兔二抗 (Vector Laboratories公司,美國),磷酸鹽緩沖液 PBS(粉劑)(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司,中國),DAB顯色試劑盒 (福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司,中國),0.01 mol/L檸檬酸組織修復(fù)液 (福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司,中國),其它試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 主要儀器 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALD I-TOF-MS,Voyager-DE STR 4349,美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司),Leica(I CCA)光學(xué)顯微鏡 (Leica公司,德國),Leica2000自動(dòng)封閉式脫水機(jī) (Leica公司,德國),Leica RM2145石蠟切片機(jī) (Leica公司,德國),Leica展片機(jī) (Leica公司,德國),蘇泊爾 A20壓力鍋(浙江蘇泊爾炊具股份有限公司,中國),Siemens電冰箱 (Siemens公司,德國),電熱恒溫干燥箱 (上海精宏醫(yī)療儀器廠,中國),電子天平 (FA1104型,上海天平儀器廠,中國),微量加樣器 (Eppendorf公司,德國),調(diào)速多用振蕩器 (Genie公司,美國)。

1.3 MR I造影劑 Gd-DTPA-GB mAb制備 將1 mgDTPABA溶于 1 ml二甲基酰胺,配成 1 g/L DTPABA溶液,將 10 g/L顆粒酶 B抗體 400 μl加入 1 g/L DTPABA溶液 400μl,室溫孵育 1 h。PD-10柱子純化,加 0.5 mol/L NaAc 3.5 ml洗脫。收集洗脫液,用 Bradford法測定抗體濃度,檢測蛋白洗脫情況。8.18 ng GdCl3加入0.5 mol/L NaAc 420μl,取 160μl該液加入洗脫液中,室溫振蕩 1 h。PD-10柱子純化,用0.15 mol/L NaCl洗脫 ,收集洗脫液 ,1 ml管分裝,4℃存放。

1.4 Gd-DTPA-GB mAb的體外試驗(yàn)

1.4.1 鑒定 Gd-DTPA-GB mAb造影劑及連接效率 Gd-DTPA-GB mAb用MALD I-TOF-MS光譜測定是否連接,并根據(jù)增加的分子量計(jì)算每分子抗體連接的 Gd3+數(shù)量。

1.4.2 細(xì)胞毒性檢測 收集對數(shù)生長期人類腎小管上皮細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室提供),調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,接種于 96孔板,每孔加入 100μl培養(yǎng)液。5%CO2、37℃孵育,至細(xì)胞單層鋪滿孔底;然后,設(shè)空白對照組及實(shí)驗(yàn)組,其中實(shí)驗(yàn)組分別加入一定濃度梯度的 Gd-DTPA-GB mAb、DTPA、Gd-DTPA及 Gd,每組各設(shè) 3個(gè)復(fù)孔,孵育 12 h,倒置顯微鏡下觀察。每孔加入 20μl MTT溶液 (5 g/L),繼續(xù) 37℃培養(yǎng) 1 h。棄上清,每孔加入 150μl異丙醇,振蕩,使結(jié)晶物充分溶解。將結(jié)晶溶解后的上清液移到酶標(biāo)板上測 570 nm吸光值。存活率 =(實(shí)驗(yàn)孔 OD/對照孔 OD)×100%,(OD值取平均值);抑制率(或增值率)=100%-存活率。以存活率 (y軸)與藥物濃度 (x軸)繪圖,如出現(xiàn)抑制情況需計(jì)算半數(shù)抑制濃度 (I C50)值。結(jié)果判斷：抑制率 ＞70%為高度敏感,50%～70%為中度敏感,＜50%為不敏感。

1.4.3 Gd-DTPA-GB mAb的免疫活性檢驗(yàn)取雄性成年 SD大鼠移植甲狀腺組織,常規(guī)石蠟包埋切片,分為實(shí)驗(yàn)組 (一抗 Gd-DTPA-GB mAb)、陽性對照組 (一抗 GB mAb)及陰性對照組 (一抗 PBS)。采用 ABC法 (avidin-biotinperoxidase complexmethod)。①具體步驟：甲狀腺組織應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法制成蠟塊,常規(guī)切片,烤片,脫蠟;3%過氧化氫室溫濕盒孵育 10 min,PBS沖洗;0.01 mol pH 6.0檸檬酸抗原修復(fù)液修復(fù),高壓冒氣 3 min,壓力鍋離開熱源,冷卻至室溫,PBS沖洗;每張切片滴加非免疫動(dòng)物血清,孵育 20 min;陽性對照組切片滴加 1∶150的抗顆粒酶 B單克隆抗體稀釋液,陰性對照組加PBS液,實(shí)驗(yàn)組滴加 1∶175的 Gd-DTPA-GB mAb造影劑稀釋液,濕盒 4℃冰箱過夜;PBS沖洗,每張切片滴加生物素化二抗,室溫濕盒孵育60 min;PBS沖洗,每張切片滴加 ABC復(fù)合物,室溫濕盒孵育 60 min;PBS沖洗,滴加新鮮配制的 DAB溶液,顯微鏡下顯色;自來水沖洗,蘇木素復(fù)染;脫水、中性樹膠封固;顯微鏡下觀察。②免疫組化結(jié)果判定：顆粒酶 B免疫陽性細(xì)胞呈棕色,由于顆粒酶 B蛋白主要分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞漿,因此陽性細(xì)胞胞膜、胞漿染色較深。通過免疫組化法比較三組之間的陽性結(jié)果表達(dá)量,從而判定 Gd-DTPA-GB mAb的免疫活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 細(xì)胞毒的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差,用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Gd-DTPA-GB mAb的鑒定及連接效率計(jì)算 MALD I-TOF-MS鑒定 Gd-DTPA-GB mAb連接產(chǎn)物,結(jié)果顯示：顆粒酶 B單抗的質(zhì)荷比高峰主要出現(xiàn)在 133986.41處 (圖 1A);連接了Gd-DTPA后,分子量增加,顯示質(zhì)荷比高峰后移,主要在 139736.06的位置 (圖 1B),表明Gd-DTPA-GB mAb已連接成功。Gd-DTPA分子量約為 500 D,通過計(jì)算增加的分子量,每分子抗體可以連接 20個(gè)左右的 Gd3+。

2.2 細(xì)胞毒性檢測 MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Gd、DTPA、Gd-DTPA以及 Gd-DTPA-GB mAb組在濃度逐漸遞增的情況下對于細(xì)胞活性沒有明顯影響 (P＞0.05),且 4組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明本研究合成的 Gd-DTPA-GB mAb對于人類腎小管上皮細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性作用 (圖 2)。

2.3 Gd-DTPA-GB mAb的免疫活性檢驗(yàn) 從顆粒酶 B陽性的組織切片上 (圖 3C)可見棕黃色沉積物主要位于間質(zhì)淋巴細(xì)胞的胞漿,典型的形狀為顆粒狀;在顆粒酶 B陰性的組織切片上間質(zhì)淋巴細(xì)胞胞漿無棕黃色沉積物存在 (圖3A)。我們新合成的造影劑 Gd-DTPA-GB mAb因連接了顆粒酶 B抗體,故理論上可以與相應(yīng)抗原結(jié)合,免疫組化結(jié)果顯示具有免疫陽性細(xì)胞 (圖 3B)。

3 討 論

MR I具有無創(chuàng),無輻射,空間分辨率高等特點(diǎn),但傳統(tǒng)MR I主要依賴非特異性成像手段進(jìn)行檢查,所以只有當(dāng)機(jī)體發(fā)生明顯的病理或解剖結(jié)構(gòu)改變時(shí)才能發(fā)現(xiàn)異常,而靶向磁共振造影劑先以雙功能絡(luò)合劑偶聯(lián)單克隆抗體,再將磁共振造影劑與之結(jié)合,利用載體本身與靶點(diǎn)作用時(shí)所具有的特異性、親和性及穩(wěn)定性來構(gòu)建。DTPA作為一種多氨多羧化合物具有鰲合能力強(qiáng),標(biāo)記簡便,作用高效等特點(diǎn),而 Gd3+由于有 7個(gè)未成對電子,自旋磁矩大,電場對稱,弛豫效率高,易與水配位,且配位水分子為 8、9個(gè),是設(shè)計(jì)單抗性造影劑最理想的選擇[12]。自Gd-DTPA問世后,就有學(xué)者用磁共振造影劑Gd標(biāo)記單抗用于靶向診斷腫瘤[4,6-7]。近年來靶向造影劑的研究更側(cè)重于敏感性和特異性的提高,應(yīng)用范圍也日趨擴(kuò)大,進(jìn)一步提示我們能否在移植領(lǐng)域展開相應(yīng)的研究。

圖1 MALD I-TOF-MS檢測 Gd-DTPA-GB mAb結(jié)合產(chǎn)物Fig.1 Petection of Gd-DTPA-GB mAb UsingMALD I-TOF-MS

圖2 MTT檢測 Gd、DTPA、Gd-DTPA及 Gd-DTPA-GB mAb組的細(xì)胞毒性Fig.2 UsingMTT assay for cytotoxicity test

圖3 Gd-DTPA-GB mAb的免疫活性檢驗(yàn)Fig.3 Using immunohistochemistry for immune activation

從已有的研究來看,靶向磁共振最大的問題在于是否有足夠的造影劑可以達(dá)到靶組織或靶細(xì)胞,以及這些造影劑是否能夠產(chǎn)生足夠的信號。由于顆粒酶 B在移植排斥組織中高表達(dá)[13],所以本實(shí)驗(yàn)采用顆粒酶B抗體與顆粒酶B高親和力的特性來實(shí)現(xiàn)靶向成像。為了提高磁共振造影劑的敏感性,增加其在靶器官的濃度,有學(xué)者[14-15]采用一系列的連結(jié)技術(shù)來提高Gd3+摩爾濃度,以產(chǎn)生足夠強(qiáng)的 T1信號。本研究結(jié)果表明,Gd3+能夠通過簡單的螯合反應(yīng)和DTPA-mAb以相對較高的濃度結(jié)合。由于顆粒酶B抗體是一種大分子 IgG,所以選擇小分子 Gd3+與之連接,使其容易穿過細(xì)胞膜與靶點(diǎn)結(jié)合;同時(shí),Gd3+與大分子蛋白的結(jié)合還可以提高 T1信號的強(qiáng)度[16]。除此之外,保持造影劑的免疫活性也是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié),具有免疫活性的造影劑才能與靶細(xì)胞順利結(jié)合。本研究采用免疫組化的方法可以簡便、直觀地看到新合成的造影劑能與顆粒酶B陽性高表達(dá)的正常 SD大鼠甲狀腺組織細(xì)胞特異性結(jié)合,說明其仍然具備較高的免疫活性。細(xì)胞毒性試驗(yàn)也表明,本研究合成的 Gd-DTPA-GB mAb對于人類NRK細(xì)胞沒有明顯的抑制作用。本研究首次成功制備了新型的靶向磁共振造影劑 Gd-DTPA-GB mAb。該造影劑在體外實(shí)驗(yàn)中可以特異性的結(jié)合顆粒酶 B,具有良好的免疫活性,對人類腎小管上皮細(xì)胞沒有明顯的殺傷作用?？梢赃M(jìn)一步應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究,為移植腎急性排斥反應(yīng)的早期特異性影像診斷提供有價(jià)值的方法。

[1] DEL IKATNY E J,POPTAN I H.MR techniques for in vivo molecμlar and cellular imaging[J].Radiol Clin North Am,2005,43(1)：205-220.

[2] MCAREER MA,S IBSONNR,VON ZUR MUHLEN C,et al.In vivo magneticresonance imaging of acute brain inflammation using microparticles of iron oxide[J].Nat M ed,2007,13(10)：1253-1258.

[3] OTSUJ I E,KUR IU Y,OKAMOTO K,etal.Monoclonalantibody A7 coupled to magnetic particles as a contrast enhancing agent for magnetic resonance imaging of human colorectal carcinoma[J].CancerI mmunol I mmunother,2006,55(6)：728-733.

[4] KUR IU Y,OTSUJ I E,K IN S,et al.Monoclonal antibody conjugated to gadoinium as a contrast aget for magnetic resonance imaging of human rectal carcinoma[J].J Surg Oncol,2006,94：144-148.

[5] BOUTRY S,BURTEA C,LAURENT S,et al.Magnetic resonance imaging of inflammation with a specific selectin-targeted contrast agent[J].Magn Reson M ed,2005,53(4)：800-807.

[6] HEY WANG-K?BRUNNERSH,SCHREER I,HE INDEL W,et al. Imaging studies for the early detection of breast cancer[J].D tsch Arztebl Int,2008,105(31-32)：541-547.

[7] MACURA K J.Advancements in magnetic resonance imaging of the prostate.[J].Top Magn Reson I maging,2008,19(6)：259-260.

[8] KOK,YAMAZAKI S,NAKAMURAK,et al.Trea tment of advanced tumors with agonistic anti-GITR mAb and its effects on tumor-infiltrating Foxp3(+)CD25(+)CD4(+)regμlatory T cells[J].J ExpM ed,2005,202(7)：885-891.

[9] L IS Q,WAER M,B ILHAU A D.Xenotransplantation：Role of natural immunity[J].Transpl I mmunol,2009,21(2)：70-74.

[10] ZHANG Z X,MA Y,WANG H,et al.Doublenegative T cells,activated by xenoantigen,lyse autologousB and T cells using a perforin/granzymedependent,Fas-Fas ligand-independentpathway[J].J I mmunol,2006,177(10)：6920-6929.

[11] PENG W,CHEN J,J IANG Y,et al.Urinary fractalkine is a marker of acute rejection[J].Kidney I nt,2008,74(11)：1454-1460.

[12] ROHRER M,BAUER H,M INTOROV ITCH J,et al.Comparison of magnetic properties of MR I contrast media solutions at different magnetic field strengths[J].Invest Radiol,2005,40(11)：715-724.

[13] L I B G,HARTONO C,D ING R C,et al.Noninvasive diagnosis of renal-allograft rejection by measurement of messenger RNA for perforin and granzyme B in urine[J].N Engl JM ed,2001,344(13)：947-954.

[14] LANZA GM,W INTER PM,CARUTHERS SD,et al.Magnetic resonance molecμlar imaging with nanoparticles[J].J Nucl Cardiol,2004,11(6)：733-743.

[15] BULTE J W M,KRA ITCHMAN D L.Iron oxide MR contrast agents for molecular and cellular imaging[J].NM R Biomed,2004,17(7)：484-499.

[16] THOREKD L,CHEN A K,CZUPRYNA J,et al.Superparamagnetic iron oxide nanoparticle probes for molecular imaging[J].Ann Biomed Eng,2006,34(1)：23-38.

[責(zé)任編輯 黃曉花 ]

Preparation of a novel targeted M R contrast agent Gd-DTPA-Granzyme B monoclonal antibody

XIE Yi,L IU Guang-yi,HAN Fei,J IANG Hong,MAO You-ying,WANG Hui-ping,ZHAO Jie,J IN Juan,CHEN Jiang-hua(Kidney D isease Center,The First Affiliated Hospital,College of M edicine,Zhejiang University,Hangzhou310003,China)

Objective：To prepare a novel MR I targeted contrast agent Gd-DTPA-Granzyme B monoclonal antibody(mAb)and to test its reaction conditions.M ethods：The Granzyme B mAb was coupled with DTPA,and then conjugated with Gd.The Gd-DTPA antibody was characterized using MALD I-TOF-MS.Cytotoxicity test was perfor med with MTT assay,and immune activation was examinedwith immunohistochemistry.Results：MALD I-TOF-MS demonstrated that the molecular weight shifted from granzyme B mAb(133986)to Gd-DTPA-GB mAb(139736),which indicated the conjugation of the antibodywith Gd-DTPA.Themolar ratio of Gd per IgGmoleculewas about 20.MTT assay showed that Gd,DTPA,Gd-DTPA and Gd-DTPA-GB mAb groups did notmake an impact on cell viability,and there were no significant differences among 4 groups(P＞0.05). Immunohistochemistry results showed that compared with the positive control group the targeted contrast agent had a high immune activity.Conclusion：The novel contrast agent Gd-DTPA-Granzyme B mAb prepared in this study keeps a good immune activity and has no significant cytotoxicity.

Magnetic resonance imaging;Pentetic acid;Gadolinium DTPA;Contrast media;Gadolinium;Spectrometry,mass,matrix-assisted laser desorption-ionization

R 914.5

A

1008-9292(2010)03-0290-06

2009-11-17

2010-04-20

國家自然科學(xué)基金 (項(xiàng)目編號 30671990);國家自然科學(xué)青年基金 (項(xiàng)目編號 30801148);115國家科技支撐計(jì)劃 (項(xiàng)目編號 2008BA I60B04).

謝 易 (1983-),女,碩士研究生,從事靶向磁共振在腎移植排斥早期診斷方面的研究.

陳江華 (1958-)男,碩士,教授,主任醫(yī)師,從事腎移植及多器官衰竭的研究;E-mail：chenjianghua@zju.edu.cn

http：∥www.journals.zju.edu.cn/med DO I：10.3785/j.issn.1008-9292.2010.03.013