呂沁風,鄭 偉,羅 鵬,吳忠華,李 禾,沈建根

(1.浙江大學醫(yī)學院,浙江杭州 310058;2.浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心,浙江杭州 310003)

嗜肺軍團菌環(huán)介導等溫擴增檢測法的建立

呂沁風1,2,鄭 偉2,羅 鵬2,吳忠華2,李 禾2,沈建根1

(1.浙江大學醫(yī)學院,浙江杭州 310058;2.浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心,浙江杭州 310003)

目的：建立一種快速簡便的嗜肺軍團菌分子檢測方法。方法：運用環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isother mal amplification,LAMP),設計一套引物特異性識別嗜肺軍團菌毒力基因——mip基因的 6個特殊區(qū)域,在恒溫條件下,對 8株嗜肺軍團菌和 5株其它細菌進行檢測,并與普通 PCR方法進行比對,驗證該方法的特異性和靈敏度。結果：所有嗜肺軍團菌擴增產(chǎn)物均產(chǎn)生肉眼可見的白色沉淀,而其它不同菌株均不產(chǎn)生沉淀;加入熒光染料 smart green后,嗜肺軍團菌擴增產(chǎn)物均產(chǎn)生強綠色熒光,其它菌株呈弱熒光。與普通 PCR(檢出限約為 57.6 pg,)比,LAMP擴增反應的靈敏度大 100倍左右,基因組 DNA檢出限為 576 fg,陽性水樣檢出限為 8 cfu/ml。結論：LAMP技術可在簡易的實驗環(huán)境中快速、特異、靈敏地檢測嗜肺軍團菌。

軍團病桿菌,嗜肺;軍團桿菌病 /診斷;基因擴增;聚合酶鏈反應 /方法;增強子元件(遺傳學)

[J ZhejiangUniv(Medical Sci),2010,39(3)：305-310.]

嗜肺軍團菌 (Legionella pneumophila)于1976年首次在美國被發(fā)現(xiàn)[1],是一種革蘭氏陰性條件致病菌,主要通過污染建筑物中的水系傳播,易大規(guī)模爆發(fā)和流行。該菌感染后發(fā)病進程快、死亡率高,在西歐國家,每年軍團菌的發(fā)病人數(shù)接近 10萬[2-3]。隨著經(jīng)濟發(fā)展,中央空調的普遍使用,軍團菌爆發(fā)的危險性日益增加,已有多個國家將軍團菌肺炎列為法定傳染病。我國衛(wèi)生部 2003年頒布了《集中式空調通風系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》,目的就是為了切斷軍團菌的傳染源和傳播途徑。由于軍團菌生長較慢,普通培養(yǎng)檢測周期較長,而且血清免疫學方法靈敏度和特異性不高,因此對其檢測存在一定的局限性[4-5]。環(huán)介導等溫擴增技術 (loop-mediated isother mal amplification,LAMP)是 Notomi等在 2000年開發(fā)的一種新型的體外擴增特異核酸片段的分子生物學技術[6-7],可在等溫條件下 1 h左右得到 109拷貝的擴增產(chǎn)物,具有高特異性、快速靈敏、操作簡便、成本低等特點。本研究運用LAMP技術原理,針對嗜肺軍團菌的 mip基因設計特異性引物,建立簡便、高效的嗜肺軍團菌檢測方法,并驗證該方法的特異性和靈敏度。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要設備和試劑 CO2孵箱購自日本三洋公司,Takara TP600型梯度 PCR儀購自日本 Takara公司,干浴模塊購自上海位點生物技術有限公司,臺式高速離心機購自 Beckman公司;電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自 Bio-RAD公司。T IANGEN細菌基因組 DNA抽提試劑盒購自上海位點生物技術有限公司,BCYE培養(yǎng)基及 GVPC選擇性培養(yǎng)基購自英國 OXO ID公司,U-LAMP通用型試劑盒、2×PCR TaqMix、20×s martgreen及核酸電泳分子量標準 DL2000購于北京美萊博醫(yī)學科技有限公司,20×Eva green購自美國 Biotium公司,瓊脂糖購自西班牙 Biowest公司,8U BstDNA聚合酶和引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.2 菌株 3株嗜肺軍團菌標準株(ATCC33152、ATCC33154、ATCC33155)購自上海寶錄生物科技有限公司,其余 5株嗜肺軍團菌為本室分離保存菌種。另外,金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌各 1株為浙江省質量技術監(jiān)督檢測研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù) GenBank公布的嗜肺軍團菌 mip基因序列 (NC_002942),用 Primer Ex plorer IV軟件分析設計一套引物,分別是前外引物 B3、后外引物 F3、前內引物 FIP和后內引物 B IP,其中 FIP是由 F1C的互補序列和 F2序列組成,B IP是由 B1C序列和 B2的互補序列組成,見圖 1和表 1。

圖1 嗜肺軍團菌mip基因的引物設計Fig.1 The primers design for the mip gene ofLegionella pneum ophila

表1 LAMP引物Table 1 LAMP pr imers

1.2.2 菌株培養(yǎng) 將嗜肺軍團菌接種于BCYE培養(yǎng)基或者 GVPC選擇性培養(yǎng)基,在 5%CO2孵箱中培養(yǎng) 2-3 d,挑取單個菌落制備模板。其它菌接種于普通營養(yǎng)肉湯中,培養(yǎng) 1 d后吸取 1 ml菌液制備模板。

1.2.3 DNA模板制備 采用 T IANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒,按說明書操作。

1.2.4 LAMP擴增反應 LAMP反應體系為20μl,組分包括 2 ×U-LAMPMix 10μl,引物混合物 1μl(體系中引物終濃度分別為：F3、B3各0.2μmol/L,FIP、B IP各 0.75μmol/L),模板DNA 1μl,8U BstDNA聚合酶 0.8μl,ddH2O 7.2μl。反應條件：混勻后將其放入干浴模塊60℃ 60 min;80℃ 10 min。

1.2.5 特異性試驗 提取嗜肺軍團菌及其它細菌的 DNA,用 LAMP方法檢測,以滅菌雙蒸水作為空白對照,驗證方法的特異性。

1.2.6 靈敏度試驗 ①基因組 DNA靈敏度試驗：取嗜肺軍團菌標準株 ATCC33152的 DNA抽提原液,10倍倍比稀釋至 10-1-10-8,分別取 2μl進行 LAMP反應,觀察沉淀反應和熒光反應。②普通 PCR反應靈敏度試驗：為了比較LAMP與普通 PCR的靈敏度,將嗜肺軍團菌ATCC33152的 DNA抽提原液,10倍倍比稀釋至 10-5,用引物 F3、B3進行擴增。PCR擴增體系如下：反應體系為 20μl,其中 2×PCR TaqMix 10μl,引物混合物 1μl,模板 DNA 1μl,ddH2O 8μl。反應條件：95℃變性 30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,30個循環(huán);72℃延伸 5 min,4℃停止。取 10μl普通 PCR產(chǎn)物觀察瓊脂糖電泳結果。

1.2.7 水樣中的檢測應用 在滅菌雙蒸水中加入已知濃度的嗜肺軍團菌標準株菌液混勻作為檢測原液,用滅菌雙蒸水 10倍倍比稀釋至10-8,各取每個稀釋度的菌液 1ml用試劑盒提取 DNA進行 LAMP擴增。

2 結 果

2.1 LAMP檢測方法的建立 本研究針對嗜肺軍團菌mip基因設計的一套特異性引物對現(xiàn)有菌株基因組進行 LAMP檢測,反應后 12 000 r/min離心 1 min觀察結果,所有嗜肺軍團菌樣本均出現(xiàn)白色沉淀 (圖 2)。將 LAMP反應的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后觀察,嗜肺軍團菌標本出現(xiàn)LAMP特有的階梯狀分布的擴增條帶 (圖 3)。LAMP反應結束后,向管內加入 1μl的 20×s mart green,在紫外下觀察,嗜肺軍團菌標本出現(xiàn)強烈的綠色熒光 (圖 4)。上述結果表明,該反應體系能有效地擴增嗜肺軍團菌的 mip基因。

圖2 LAMP沉淀反應Fig.2 LAMP precipitation reaction

圖3 LAMP產(chǎn)物電泳圖Fig.3 The electrophoresis results of LAMP products

圖4 LAMP產(chǎn)物熒光檢測Fig.4 The LAMP products with fluorescence detection

2.2 LAMP特異性試驗 如圖 2-圖 4所示,嗜肺軍團菌均能擴增出陽性結果,其它非嗜肺軍團菌和空白對照無白色沉淀,瓊脂糖電泳無條帶,加入熒光染料后顯色很弱。由此可見,本實驗所設計的嗜肺軍團菌 LAMP檢測方法具有良好的特異性。

2.3 靈敏度試驗

2.3.1 LAMP靈敏度實驗 測定嗜肺軍團菌ATCC33152DNA抽提原液濃度為 576 ng/μl,10倍倍比稀釋,進行 LAMP反應,如圖 5可見,在第 6管即稀釋到 106倍,仍可擴增產(chǎn)生白色沉淀,第 7管未見白色沉淀。由此可確定基因組DNA檢測限約為 576 fg/μl。當 LAMP反應結束后,加入 20×smart green,在紫外燈下觀察 (圖 6),同沉淀反應,DNA抽提原液稀釋至 106倍,還可觀察到強烈的綠色熒光反應;但是,陰性反應也有熒光干擾。

圖5 嗜肺軍團菌 LAMP檢測靈敏度沉淀法檢測結果Fig.5 The sensitivity ofLAMP-precipitation testforLegionella pneum ophila

圖6 嗜肺軍團菌 LAMP檢測靈敏度試驗熒光檢測結果Fig.6 The sensitivity of LAMP fluorescencedetection forLegionella pneum ophila

2.3.2 普通 PCR靈敏度試驗 取各稀釋度的普通 PCR擴增產(chǎn)物各 10μl,marker DL2000分子量標準 5μl/泳道。1%瓊脂糖凝膠在 120 V電壓下電泳 25 min,用凝膠紫外分析儀觀察(圖 7),結果 PCR擴增片段大小為 241 bp,與理論值相符;在泳道 5可見較弱的擴增產(chǎn)物,在泳道 6已不可見擴增產(chǎn)物。由此可見,普通PCR擴增的檢出限約為 57.6 pg/μl,LAMP擴增反應的靈敏度比普通 PCR大 100倍左右。

圖7 嗜肺軍團菌普通 PCR靈敏度試驗Fig.7 The sensitivity of conventional PCR for the detection ofLegionella pneum ophila

2.4 水樣中的檢測應用 經(jīng)平板計數(shù),嗜肺軍團菌原菌液濃度為 8×107cfu/ml,10倍倍比稀釋至 107倍,試劑盒提取 DNA,LAMP檢測后,仍產(chǎn)生肉眼可見的白色沉淀;稀釋度為 10-8沒有沉淀生成,說明陽性水樣的檢出限在 8 cfu/ml左右。

3 討 論

嗜肺軍團菌一般人群普遍易感,因此有必要研究高效快速嗜肺軍團菌檢測技術。但常規(guī)培養(yǎng)要求苛刻,細菌生長緩慢,一般從水樣收集到培養(yǎng)鑒定需要 7～10 d[4-5];再者,培養(yǎng)結果受標本采集質量、操作技術的影響,陽性率不一。LAMP技術是一種新興的分子檢測技術,不需特殊的分子生物學儀器設備和嚴格的實驗條件,在簡易環(huán)境中就可實現(xiàn)快速檢測。由于嗜肺軍團菌mip蛋白是嗜肺軍團菌的主要毒力因子[8-9],因此本研究選擇mip基因序列設計一套特異性引物,建立嗜肺軍團菌LAMP檢測方法。

LAMP是對靶基因的 6個特征區(qū)域設計 4種引物,利用具有鏈置換活性的 Bst DNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成,從而使靶基因高效擴增。它的產(chǎn)物是由多重復靶序列的莖-環(huán)狀 DNA和花椰菜狀 DNA所組成的混合物,在瓊脂糖凝膠電泳上會呈現(xiàn)出 LAMP所特有的階梯狀條帶[10-11]。LAMP反應過程將產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子,與鎂離子結合生成白色的焦磷酸鎂沉淀,可根據(jù)快速離心或者濁度變化,直觀觀察檢測結果,在基層或者落后地區(qū)技術人員只需簡單培訓就可完成實驗操作。本研究根據(jù)沉淀反應、產(chǎn)物電泳以及熒光檢測結果,證實 LAMP技術檢測嗜肺軍團菌具有良好的特異性;嗜肺軍團菌的擴增結果均為陽性,其它不同細菌均為陰性。通過比對發(fā)現(xiàn),LAMP方法對基因組 DNA擴增靈敏度相比普通 PCR高出 2個數(shù)量級左右。而許多研究也已表明,LAMP技術可檢測到 10個拷貝數(shù)甚至更低的靶標,在檢測靈敏度上具有巨大的優(yōu)勢[12-14]。本方法從 DNA抽提開始約 1.5 h即可完成實驗,大大縮短了檢測時間。同時其擴增反應在恒溫條件下即可完成,不需要特殊的儀器設備。本研究采用兩種方法直接觀察實驗結果,反應后直接加入熒光染料在紫外燈下檢測時,由于陰性樣品中有 DNA和引物存在,故而也有微弱熒光信號,且離心管本身存在一定的熒光信號,對擴增結果觀察有一定干擾。因此,建議使用沉淀法觀察結果更為簡便易行。

LAMP區(qū)別于此前經(jīng)典的 PCR技術,LAMP具有不需要特殊的精密昂貴的儀器設備和嚴格的實驗條件,操作簡便,成本低廉,省略了傳統(tǒng) PCR方法變性、退火、延伸的過程,大大節(jié)約了反應時間,特別適用于現(xiàn)場檢測,為基層小型實驗室、出入境口岸等機構提供了一種新型的核酸檢測技術,在病原體檢測中有較好的應用前景。

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[責任編輯 黃曉花 ]

Establishment ofloop-mediated isothermal amplification method for detection ofLegionella pneum ophila

LU Qin-feng1,2,ZHENG Wei2,LUO Peng2,WU Zhong-hua2,L I He2,SHEN Jian-gen1(1.College of M edicine,Zhejiang University,Hangzhou310058,China; 2.Zhejiang International Travel Healthcare Center,Hangzhou310003,China)

Objective：To establish a simple and rapid molecular detection forLegionella pneumophila.M ethods：The loop-mediated isother mal amplification(LAMP)was applied for detection ofLegionella pneum ophila.A set of primers were designed to identify six special areas in mip gene ofLegionella pneum ophila.Genomic DNAs from 13 bacterial strains,including 8Legionella pneum ophilastrains and 5 other bacterial strainswere amplified by LAMP and general PCR method to evaluate the specificity and sensibility ofLAMP.Results：All positive tubes produced visible white precipitation,and no precipitation was observed in others.By adding smart green fluorescent dye,allLegionella pneum ophilapositive tubes presented a strong green fluorescence,while others showed weak fluorescence.The detection rate ofLAMP was higher than that of general PCR.The detection limits were 576fg with genomic DNA ofLegionella pneum ophila,and 8 cfu/mL with positive water samples.Conclusion：LAMP detection ofLegionella pneum ophilais an effective and low-costmethod with high specificity and sensitivity requiring no special equipment.

Legionella pneum ophila;Legionellosis/diag;Gene amplification;Polymerase chain reaction/methods;Enhancerelements(genetics)

R 378.99

A

1008-9292(2010)03-0305-06

2009-10-27

2010-03-20

呂沁風 (1981-),女,碩士生,主管技師,從事傳染病檢測工作.

沈建根 (1952-),男,副研究員,主要從事分子免疫研究,E-mail：SJG7217143@sina.com

http：∥www.journals.zju.edu.cn/med DO I：10.3785/j.issn.1008-9292.2010.03.015