王紅艷,朱建星,張萬忠,楊 穎

(沈陽化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院,遼寧沈陽 110142)

多胺柔性鏈改性殼聚糖微球固定化木瓜蛋白酶

王紅艷,朱建星＊,張萬忠,楊 穎

(沈陽化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院,遼寧沈陽 110142)

用反相懸浮交聯(lián)法制備了單分散殼聚糖微球樹脂,以其作為固定化載體基體,經(jīng)氨基保護(hù)、C6羥基環(huán)氧化后接枝親水性多乙烯多胺,制備了粒徑為 220～300μm、具有較高機(jī)械強(qiáng)度的多胺柔性鏈改性殼聚糖載體。采用該載體對(duì)木瓜蛋白酶在 pH8.0緩沖液中室溫下固定 25h,固定化酶表觀活力最高可達(dá) 313U·g-1,活力回收率最高達(dá) 61.5%,是采用未經(jīng)多胺分子修飾的殼聚糖微球固定化的 2.3倍。該柔性固定化酶的最適溫度為 65℃,最適 pH為 8.0,連續(xù)使用6～7次后仍保持原來活力的一半。

殼聚糖,多乙烯多胺,固定化載體,微球,木瓜蛋白酶

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 濟(jì)南海得貝海洋生物有限公司,脫乙酰度 86.9%;多乙烯多胺 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;木瓜蛋白酶 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑 均為市售分析純。

精密增力電動(dòng)攪拌器 常州國華 JJ-1;傅立葉變換紅外光譜儀 Nicolet NEXUS470;掃描電鏡JEOL JS M-6360LV;恒溫振蕩器 常州國華 SHA-B;紫外分光光度計(jì) 尤尼柯UV2000。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殼聚糖微球的制備 按文獻(xiàn)[9]方法并適當(dāng)放大：稱取 10g殼聚糖,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2%的乙酸溶液中,配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5%的殼聚糖溶液,再加入一定量的 PEG2000,然后加入 200mL液體石蠟,適量的乳化劑 span80,高速攪拌 30min使體系成乳液狀,然后加入 28mL甲醛攪拌 1h,將乳液倒入 500mL w(NaOH)=10%的 NaOH/無水乙醇 [V(NaOH)∶V (無水乙醇)=1∶1]的混合液中攪拌 10min,靜置 2h,用二甲苯、無水乙醇、蒸餾水等充分洗滌,50℃真空干燥,得到 CS微球備用。

1.2.2 多胺柔性鏈改性殼聚糖固定化載體的制備[9]

稱取 6g CS微球加入單口燒瓶中,再加入 100mL甲醇,滴加苯甲醛 40mL,然后移至 60℃中反應(yīng) 16h,充分洗滌后得殼聚糖的苯甲醛 Schiff堿 (BCS)。取8g BCS微球浸泡在適量氫氧化鈉水溶液中,緩慢加入80mL環(huán)氧氯丙烷,50℃反應(yīng)6h。經(jīng)抽濾洗滌后得環(huán)氧基殼聚糖苯甲醛 Schiff堿 (EBCS)。再將 EBCS微球置于100mL乙醇中,加入110mL多乙烯多胺、適量氫氧化鈉水溶液,55℃反應(yīng) 6h。充分洗滌后得胺化殼聚糖苯甲醛 Schiff堿(T BCS)。最后將胺化產(chǎn)物加入 200mL 0.25mol/L的鹽酸中攪拌 48h充分脫醛,用氫氧化鈉調(diào)到弱堿性后用蒸餾水充分洗滌,干燥,得最終產(chǎn)品 TCS,以酸堿滴定法測(cè)定載體的氨基含量。

1.2.3 木瓜蛋白酶的固定化 取 10g多胺柔性鏈改性殼聚糖微球載體,加入 35mL戊二醛溶液,于乙醇介質(zhì)中 60℃反應(yīng) 2～3h,然后用蒸餾水反復(fù)洗滌,真空干燥,稱取干燥產(chǎn)品 0.25g,加入一定量的木瓜蛋白酶,于 pH8.0的 Tris-HCl緩沖液中室溫振蕩反應(yīng)25h,固定化酶用蒸餾水和緩沖液洗滌數(shù)次,至洗滌液中無蛋白質(zhì)檢出,然后檢測(cè)固定化酶的活力。

1.2.4 酶的活力測(cè)定 在錐形瓶中依次加入 1mL酶液 (或 0.25g固定化酶)、3mL酶激活劑 (含 0.005mol/L半胱氨酸和 0.002mol/LEDTA的 Tris-HCl緩沖液),37℃水浴中預(yù)熱 5～10min后,加入 10mL已預(yù)熱的酪蛋白溶液 (1%的 Tris-HCl緩沖液),搖勻,在 37℃水浴中精確反應(yīng) 10min,然后加入 10mL三氯醋酸溶液 (10%),劇烈搖動(dòng),過濾,用茚三酮比色法測(cè)定濾液中的酪氨酸含量,以每分鐘釋放 1μg的酪氨酸的酶量定義為一個(gè)活力單位(U)。對(duì)照空白：在加入底物之前加入三氯醋酸終止劑。其余步驟同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 載體的表征

2.1.1 紅外光譜分析 圖1表明：主要中間體及產(chǎn)物的紅外光譜均具有殼聚糖特有的 1651cm-1處的酰胺Ⅰ譜帶ν(C=O)、1601cm-1酰胺Ⅱ譜帶δ(N-H)、1313cm-1酰胺Ⅲ譜帶ν(C-N)及 898cm-1吡喃苷環(huán)振動(dòng)吸收峰。殼聚糖苯甲醛化產(chǎn)物 (BCS)在 1598、755、691cm-1處有明顯的苯環(huán)骨架特征吸收峰,在1647cm-1處出現(xiàn)ν(C=N)伸縮振動(dòng)吸收峰,說明了殼聚糖苯甲醛 Schiff堿的生成。環(huán)氧化產(chǎn)物 (EBCS)在 1257cm-1處羥基的變形振動(dòng)吸收峰接近消失,在1028cm-1處 C6羥基 C-O鍵伸縮振動(dòng)吸收峰明顯變?nèi)?說明在 C6-OH上發(fā)生了反應(yīng)。胺化反應(yīng)后脫醛產(chǎn)物(TCS)相應(yīng)的苯環(huán)骨架的吸收峰已消失,表明苯甲醛已脫去。在 1072cm-1處仲羥基ν(C-O)伸縮振動(dòng)吸收峰明顯增強(qiáng),說明環(huán)氧基與多胺反應(yīng)后生成了新的仲羥基。在 1558cm-1處δ(NH2)彎曲振動(dòng)吸收峰增強(qiáng),3500～3200cm-1之間的吸收峰變寬, 1457cm-1附近的亞甲基δ(C-H)彎曲振動(dòng)吸收峰明顯增強(qiáng),這都說明多乙烯多胺柔性鏈改性殼聚糖的生成。

圖1 主要中間體及產(chǎn)物的紅外光譜圖

2.1.2 掃描電鏡 圖 2為載體的 SE M照片,顯示多胺柔性鏈改性殼聚糖微球粒徑為 220～300μm,且較為均一,表面較為光滑,這利于減少固定化酶催化反應(yīng)過程中的內(nèi)擴(kuò)散限制效應(yīng)。采用本方法合成的多胺柔性鏈改性殼聚糖微球在稀鹽酸和乙酸等有機(jī)酸中長時(shí)間浸泡均保持單分散微球形態(tài),抗酸性能顯著增強(qiáng),可被現(xiàn)有工業(yè)反應(yīng)器篩板 (最小孔徑約200μm)截留,從而易于實(shí)現(xiàn)與產(chǎn)物分離,能夠?qū)崿F(xiàn)重復(fù)使用。

圖 2 多胺柔性鏈改性殼聚糖微球的掃描電鏡圖

2.2 木瓜蛋白酶的固定化

2.2.1 酶用量對(duì)固定化酶的影響 在 24℃,pH8.0的條件下,以 TCS載體在不同酶用量的條件下固定20h,制備固定化酶,結(jié)果見圖 3。由圖 3可知,隨著固定化酶用量的提高,固定化酶活力在不斷升高,酶量少(2～6mg·g-1干球)時(shí)上升的速度快,酶量多 (大于 6～12mg·g-1干球)時(shí)固定化酶活力增加趨緩,酶量為 12mg·g-1干球時(shí)固定化酶活力可達(dá) 303.4U·g-1。由圖 3還可知,酶用量從 2～4mg·g-1干球增加到8～12mg·g-1干球時(shí),活力回收率由 51%～60.5%下降到 34.4%～37.4%。其原因一方面是固定在載體表面的酶分子會(huì)對(duì)游離的酶分子產(chǎn)生位阻效應(yīng),反應(yīng)體系中的酶分子達(dá)到一定濃度時(shí),被固定在載體表面的酶分子趨于飽和,當(dāng)酶用量增加時(shí),被固定化的酶量并未按比例增加,表現(xiàn)為酶活力回收率下降;另一方面,固定化反應(yīng)體系中的酶量多時(shí),也可造成酶分子被非定向固定化在載體表面,有些酶分子的構(gòu)象發(fā)生改變甚至活性中心被遮蔽,使固定化酶活力未與被固定的酶蛋白量成比例增加,酶活力回收率亦下降。

圖 3 酶用量對(duì)固定化酶活力及活力回收率的影響

2.2.2 固定化時(shí)間的確定 選用 TCS載體,游離酶投加量為 12mg/g干球,在 24℃,pH8.0的條件下對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行固定化,在不同的固定化時(shí)間后測(cè)定了固定化酶的活力,結(jié)果見圖 4。由圖 4可知,采用 TCS載體,隨著固定化時(shí)間的延長,固定化酶的活力先上升,固定化 25～30h固定化酶活力達(dá)到 313～321U·g-1,而后下降。這是因?yàn)槊阜肿釉诠潭ɑ跗诓粩啾唤Y(jié)合到載體上,使固定化酶活力迅速上升;而在固定化后期,隨著固定化時(shí)間的延長,載體表面結(jié)合的酶分子相對(duì)擁擠,酶分子的空間構(gòu)象也會(huì)發(fā)生細(xì)微變化,一方面造成了擴(kuò)散限制效應(yīng)和空間障礙效應(yīng),影響了底物與酶分子活性中心的接近及產(chǎn)物的傳質(zhì)擴(kuò)散,使固定化酶活力下降。此外,由于固定化體系中酶分子的熱穩(wěn)定性隨時(shí)間的延長而變差所造成的活力下降也是重要原因之一,最佳固定化時(shí)間可確定為 25～30h。

圖 4 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響

2.2.3 固定化體系 pH的確定 用 TCS載體,游離酶投加量為 12mg/g干球,于室溫下分別在不同 pH的緩沖液中對(duì)木瓜蛋白酶固定化 25h,結(jié)果見圖 5。由圖 5可知,該固定化過程在 pH為 8.0的偏堿性條件下效果最好。

圖5 固定化 pH對(duì)固定化酶活力的影響

2.2.4 不同載體固定化木瓜蛋白酶活力比較 選用CS微球、TCS微球分別與適量戊二醛偶聯(lián)后,對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行固定,結(jié)果見表 1?？梢钥闯?多胺柔性鏈改性殼聚糖微球(氨基含量 3.5～3.9mmol·g-1)對(duì)木瓜蛋白酶固定化效果顯著,表觀活力最高達(dá) 313U·g-1,高于文獻(xiàn)[7-8]以雙醛淀粉作為柔性鏈的固定化水平,固定化酶活力回收率達(dá) 34.8%～61.5%,都高于采用未經(jīng)多胺修飾的 CS微球固定化 (CS微球固定化酶活力最高 134U·g-1,活力回收 15%～25%),呈現(xiàn)出良好的催化活性和工業(yè)應(yīng)用潛力。與單純殼聚糖微球相比,多胺柔性鏈改性殼聚糖微球提高了氨基含量也即提高了載酶量;而且由于親水性多胺柔性鏈的存在,不僅減小了固定化酶的空間位阻,還可提高被固定的酶分子的自由度,從而得到較高的酶活回收率,也印證了“柔性固定化優(yōu)于手臂固定化”[7-8]的觀點(diǎn)。

表 1 不同載體固定化木瓜蛋白酶活力比較

2.3 固定化木瓜蛋白酶的性能

2.3.1 固定化木瓜蛋白酶的最適溫度 以 pH8.0的酪蛋白溶液為底物,將一定量的固定化酶在 40～80℃的條件下測(cè)定相應(yīng)的酶活力,結(jié)果(圖 6)顯示：固定化酶的最適溫度為 65℃,比游離木瓜蛋白酶的最適溫度(50℃)更高,且使用溫度范圍較寬。

2.3.2 固定化木瓜蛋白酶的最適 pH 以 pH6.5～8.5的緩沖液配制的酪蛋白溶液為底物,測(cè)定固定化酶在不同 pH下的酶活力。結(jié)果(圖 7)顯示：固定化酶的最適 pH為 8.0,與游離木瓜蛋白酶的最適 pH (7.0～7.5)相比,向堿性方向偏移。

表 2 連續(xù)批次使用的固定化酶活力

圖6 溫度對(duì)固定化酶活力的影響

圖7 pH對(duì)固定化酶活力的影響

圖 8 固定化酶的Lineweaver-Burk圖

2.3.4 固定化酶的使用批次 由表2看出,固定化酶連續(xù)使用 6～7次后仍保持原來的活力的一半。

3 結(jié)論

以構(gòu)建新型柔性固定化載體為目標(biāo),從單分散殼聚糖微球樹脂出發(fā),以其作為固定化載體基體,經(jīng)氨基保護(hù)、C6羥基環(huán)氧化后接枝親水性多乙烯多胺柔性鏈,制備了粒徑為 220～300μm、具有較高機(jī)械強(qiáng)度的多胺柔性鏈改性殼聚糖載體。采用該載體對(duì)木瓜蛋白酶在 pH8.0緩沖液中室溫下固定 25h,固定化酶表觀活力最高可達(dá) 313U·g-1,活力回收率最高達(dá)61.5%,是采用未經(jīng)多胺分子修飾的殼聚糖微球固定化的 2.3倍。該柔性固定化酶的最適溫度為 65℃,最適 pH為 8.0,連續(xù)使用 6～7次后仍保持原來的活力的一半。表明多胺柔性鏈改性殼聚糖載體固定化木瓜蛋白酶活力大大高于非修飾殼聚糖微球固定化酶,且性質(zhì)穩(wěn)定,并可被現(xiàn)有最小孔徑的工業(yè)反應(yīng)器篩板截留,從而易于實(shí)現(xiàn)與產(chǎn)物分離,能夠?qū)崿F(xiàn)重復(fù)使用。

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Immobilization of papain on flexible polyethylenam ine chain modified chitosan m icrospheres

WANG Hong-yan,ZHU Jian-x ing＊,ZHANGWan-zhong,YANG Y ing
(College of Environment&Biology Engineering,Shenyang Institute of Chemical Technology,Shenyang 110142,China)

M onod isp e rse chitosan m ic rosp he res in the range220μm to300μm we re p rep a red as supp ort m a trix for mim ob ilized enzym e by p hase-inve rs ion susp ens ion c ross-linking technique firs tly,then flexib le p olye thylenam ine cha in m od ified chitosan m ic rosp he res w ith m ore am ino g roup content and be tte r m echanica l res is tance we re p rep a red by reac tion of p olye thyleneam ine and ep oxy-ac tiva ted chitosan.Pap a in was imm ob ilized on the supp ort. The app a rent ac tivity of the imm ob ilized Pap a in reached313U/g unde r those imm ob iliza tion cond itions：pH8.0, and reac tion t im e25h a t room temp e ra ture.The m os t recove ry of imm ob ilized Pap a in ac tivity reached61.5%,which was about2.3t im es tha t as imm ob iliza tion on p ure chitosan m ic rosp he re.The p rop e rties of the imm ob ilized p ap a in we re a lso s tud ied.The bes t app lica tion temp e ra ture and pH we re65℃and8.0resp ec tive ly.W hen used continuous ly for6～7t im es,the ac tivity of the imm ob ilized p ap a in would fa ll by nea rly ha lf.

chitosan;p olye thyleneam ine; imm ob iliza tion supp ort;m ic rosp he re;p ap a in

TS201.2+5

A

1002-0306(2010)03-0267-04

固定化酶在醫(yī)藥、化工、不對(duì)稱合成、食品、水處理、新能源開發(fā)等領(lǐng)域中具有廣闊的研究和應(yīng)用前景,高效固定化酶的制備技術(shù)已成為酶法生產(chǎn)工藝的核心問題,構(gòu)建性能優(yōu)良的載體往往是酶固定化成功與否的關(guān)鍵。將酶分子共價(jià)結(jié)合于載體上,酶與載體結(jié)合牢固,可長時(shí)間連續(xù)重復(fù)使用,符合工業(yè)化應(yīng)用的要求。相比無機(jī)載體結(jié)合酶量較低及聚苯乙烯等高分子載體親水性差的缺點(diǎn),采用來源豐富、生物相容性好且親水的殼聚糖 (chitosan,CS)作為固定化載體是一種較好的選擇。除了溶于一些低濃度無機(jī)酸和有機(jī)酸之外,殼聚糖幾乎具備了作為優(yōu)良固定化載體的全部性質(zhì),在固定化酶并保持其活性方面有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)[1]。研究表明,增加載體的親水性、增加載體活性側(cè)基手臂分子的長度有利于提高固定化酶活性[2-6]。近年來又有學(xué)者考慮到這些手臂分子鏈較短或有疏水性,提出了酶的“柔性固定化”[7-8]：在固定化載體上連接有足夠長度的、親水的分子鏈,即所謂的“柔性鏈”,而后再將酶結(jié)合到柔性鏈上。但迄今為止此類研究中采用的柔性鏈還僅有雙醛淀粉一種,并且雙醛淀粉的水溶性尚不能令人滿意,其本身還具有分子剛性,故仍需制備優(yōu)良的“柔性固定化載體”,以進(jìn)一步提高固定化酶的性能。為了適應(yīng)酶法生產(chǎn)工藝的實(shí)際要求,將殼聚糖制備成機(jī)械強(qiáng)度高、具有大比表面積的微球形載體并接枝親水性多胺,將有助于提高載酶量、固定化酶活性及重復(fù)使用性,是一種較為經(jīng)濟(jì)的方法。作者制備了具有較高機(jī)械強(qiáng)度的多胺柔性鏈改性殼聚糖微球載體[9],在已有工作的基礎(chǔ)上,本文進(jìn)一步考察了固定化木瓜蛋白酶的條件及固定化木瓜蛋白酶的性質(zhì)。固定化載體的合成及酶的固定化反應(yīng)路線如下：

2009-07-27 ＊通訊聯(lián)系人

王紅艷(1976-),女,講師,研究方向：生物催化劑的制備。

遼寧省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃資助(05L344)。