馬春麗,張?zhí)m威

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150090)

高產(chǎn)酸性能乳酸菌的篩選及產(chǎn)酸機(jī)理研究

馬春麗1,張?zhí)m威2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150090)

為選擇產(chǎn)酸性能優(yōu)良的乳酸菌用于酸奶生產(chǎn),本實驗對生產(chǎn)酸奶常用的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的產(chǎn)酸能力進(jìn)行了研究,測定了其發(fā)酵過程中滴定酸度和 pH的變化,并對其產(chǎn)酸機(jī)理進(jìn)行了初探。研究結(jié)果表明,乳酸菌各菌株的產(chǎn)酸能力各不相同,菌株 T M111-S產(chǎn)酸速度較快,pH下降速度較快,發(fā)酵凝乳最終 pH較低。乳酸菌產(chǎn)酸能力與菌體細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的量相關(guān)。篩選性能優(yōu)良乳酸菌菌株對生產(chǎn)高質(zhì)量的酸奶,提高工業(yè)化生產(chǎn)效率具有一定的意義。

酸奶,乳酸菌,酸度,β-半乳糖苷酶

在酸奶生產(chǎn)中使用的發(fā)酵劑菌種的性能直接關(guān)系到酸奶質(zhì)量的好壞,篩選性能優(yōu)良的菌株,對生產(chǎn)高質(zhì)量的酸奶意義重大。產(chǎn)酸力是乳酸菌的重要特性,快速產(chǎn)酸的乳酸菌在發(fā)酵過程中可以縮短發(fā)酵時間,提高生產(chǎn)效率。本實驗以生產(chǎn)酸奶的兩種常用乳酸菌——保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的多個菌株為實驗菌株,篩選其首要特性產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

菌株代號 T M111-S、G-3、3#、7#、9#、1.1#,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院貯藏;脫脂乳粉、鄰-硝基酚(ONP) 購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG) 購自 Sigma公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

751-紫外可見分光光度計,冷凍離心機(jī)(Beckman),pHS-25型酸度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗菌株發(fā)酵性能測定 以 3%接種量將菌種接入 12%的滅菌脫脂乳中進(jìn)行酸奶制作,每隔 1h取樣測定酸度,同時測定 pH,以時間為橫坐標(biāo),分別以酸度和 pH為縱坐標(biāo)繪圖,觀察酸度變化。記錄各菌株所制作酸奶的凝乳時間,測定凝乳時的酸度和pH,觀察其組織狀態(tài),比較各菌株的發(fā)酵性能。

1.2.2 發(fā)酵酸度檢測方法 發(fā)酵乳的酸度采用吉爾涅爾度(°T)表示;pH測定采用 PHS-25型酸度計直接測定。

1.2.3 發(fā)酵過程菌體乳糖酶的提取及活力測定

1.2.3.1 發(fā)酵過程菌體乳糖酶的提取 酸奶樣品充分混合后取適量樣品,每克酸奶樣品溶于 20mg 1% EDTA(pH12,4℃)溶液中,離心 (4℃,5400×g, 10min),去除上清液,將菌體細(xì)胞沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次。將菌體細(xì)胞懸浮于磷酸鹽緩沖液中,配成菌體濃度為 100mg/mL的懸液,采用 5%氯仿, 45℃保溫 8～12h對菌體進(jìn)行破壁,離心 (4℃,10000 ×g,10min),得無細(xì)胞酶提取液,待測酶活 (楊貞耐, 1989;J.P.Burton,1997)。

1.2.3.2 ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 濃度梯度為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14μmol ONP/mL,按下面方法制備:準(zhǔn)確稱取 139mg ONP于 1000mL容量瓶中,用 10mL 95%的乙醇溶解,用水稀釋定容,混勻。用移液管分別取 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0mL上述配制溶液,分別加到 100mL容量瓶中,每個容量瓶中加入 25mL NaCO3溶液 (50g NaCO3和 37.2g EDTA于 1000mL容量瓶中,少量水溶解稀釋),用磷酸鹽緩沖液稀釋,混勻。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗。在分析過程中，多組間的數(shù)據(jù)比較處理采用One-way ANOVA方法進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

以水作空白,用 10mm比色杯在 420nm下測定每個ONP標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值,以 ONP濃度為橫坐標(biāo),吸光值(OD)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 樣品中乳糖酶活力的測定 采用 ONPG為酶作用底物,生成有色產(chǎn)物 ONP,通過比色法來測定,重復(fù) 3次取平均值。在此條件下,每分鐘從培養(yǎng)基臨-硝基酚-β-D-吡喃半乳糖苷 (ONPG)中釋放出 1.30mmol臨-硝基苯酚(ONP)所需的酶量定義為一個酶活單位(NLU)(C.G.Vinderola,2003)。

1.2.3.4 發(fā)酵液中β-半乳糖苷酶活力的測定 將活化后的菌種按 1%接種量接種于液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)一定時間,將發(fā)酵液離心 (5400×g, 15min),傾去上清液,取沉淀,用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次,收集菌體,將其配成濃度為 100mg菌體/mL緩沖液的懸液,破壁,離心 (4℃,10000×g,10min),得無細(xì)胞酶提取液,待測酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗菌株的發(fā)酵產(chǎn)酸性能

將 6株乳酸菌菌株制備發(fā)酵劑,進(jìn)行脫脂乳發(fā)酵實驗,觀察酸度變化(圖 1)。

圖 1 乳酸菌菌株發(fā)酵過程產(chǎn)酸曲線

由結(jié)果可以看出,不同菌株發(fā)酵產(chǎn)酸性能有差異,各菌株發(fā)酵酸度均隨發(fā)酵時間的延長逐漸增大, pH逐漸降低。菌株 T M111-S、G-3發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)酸性能較佳,pH下降較快。

在相同培養(yǎng)條件下利用各菌株制備發(fā)酵乳凝乳時酸度、pH和凝乳時間見表 1,結(jié)果顯示,6株菌產(chǎn)酸能力順序為 T M111-S、G-3、3、9、7、1.1,菌株T M111-S凝乳時間最短,產(chǎn)酸能力最高,凝乳時 pH最低,達(dá)到 4.78,因此選擇快速產(chǎn)酸菌株直接關(guān)系到酸奶生產(chǎn)所需時間。

表 1 各菌株的發(fā)酵性能

2.2.1 ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果見圖 2。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為 Y=4.3179X +0.0096,相關(guān)系數(shù) R2=0.9991,其中 Y:420nm處的吸光度;X:鄰硝基苯酚的濃度(μmol/mL)。

圖2 ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 β-半乳糖苷酶在酸奶發(fā)酵過程中的活力變化

在脫脂乳發(fā)酵過程中對 T M111-S發(fā)酵劑菌體產(chǎn)生的糖代謝酶:β-半乳糖苷酶的活力進(jìn)行測定,結(jié)果見表2。

表 2 β-半乳糖苷酶在酸奶發(fā)酵過程中的變化(ˉX±SD,n=3)

隨發(fā)酵時間的延長,β-半乳糖苷酶活性逐漸增強(qiáng),酸度逐漸升高。乳糖經(jīng)乳酸菌的作用一部分轉(zhuǎn)變成乳酸,是通過乳酸菌的β-半乳糖苷酶作用,將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖,之后單糖被分解代謝產(chǎn)生乳酸。有研究表明,將乳糖經(jīng)β-半乳糖苷酶分解代謝為葡萄糖和半乳糖的步驟為乳糖代謝的限速步驟。從結(jié)果可以看到,在酸奶制品發(fā)酵過程中,菌體細(xì)胞在此過程中始終產(chǎn)生β-半乳糖苷酶,并隨發(fā)酵時間的延長,其活力逐漸上升。與此相對應(yīng),產(chǎn)生的乳酸量逐漸增加,pH逐漸降低。當(dāng)β-半乳糖苷酶催化下產(chǎn)生的乳酸不足以抑制其活性時,它就會繼續(xù)分解乳糖產(chǎn)生乳酸 (郭清泉,2002),使發(fā)酵乳的酸度繼續(xù)升高?？梢?乳酸的產(chǎn)生和β-半乳糖苷酶的活性呈正相關(guān)。

2.3 菌株在發(fā)酵液中酶活力的比較

經(jīng)液體培養(yǎng)發(fā)酵一定時間后得菌體,進(jìn)行酶活力的測定,測定菌株的酶活曲線如表 3所示。

表 3 菌株在發(fā)酵液中乳糖酶活力變化(ˉX±SD,n=3)

菌株酶活力隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增大,但在發(fā)酵后期酶活力趨于平穩(wěn),可能是乳糖經(jīng)β-半乳糖苷酶的分解所產(chǎn)生的乳酸,反過來又抑制β-半乳糖苷酶的活性。結(jié)果顯示,T M111-S和 G-3產(chǎn)酶能力較強(qiáng),這與它們產(chǎn)酸能力相對應(yīng)。

3 結(jié)論

乳酸菌菌株間產(chǎn)酸能力存在差異,通過實驗比較,T M111-S菌株產(chǎn)酸能力較強(qiáng),乳酸菌產(chǎn)酸能力與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的量具有相關(guān)性,本研究為高產(chǎn)酸菌株的篩選奠定了理論基礎(chǔ)。

[1]陳鐵濤 .克魯維酵母培養(yǎng)特性及透性化細(xì)胞乳糖酶的研制與應(yīng)用[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,1998.

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[3]J P Burton.Properties of porcine and yogurt lactobacilli in relation to lactose intolerance[J].J Dairy Sci,1997,80:2318 -2324.

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[5]王璋 .食品化學(xué)[M].北京 .中國輕工業(yè)出版社,1999.

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Study on screen ing of high acid-produing stra ins and mechan ism of acid-produing

MA Chun-li1,ZHANG Lan-wei2
(1.College of Food Science,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin 150030,China; 2.College of Food Science and Technology,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

Lac tic ac id bac te ria(LAB)s tra ins we re se lec ted from S trep tococcus the rm op hilus(S.t)and Lac tobac illus bulga ricus(L.b)which we re w ide ly used in the p rep a ra tion of yogurt,and the ir ac id-p roduc ing cap ab ility was s tud ied in orde r to sc reen out high ac id-p roduc ing bac te ria from LAB.The changes in titrab le ac id ity and pH of s ix LAB s tra ins we re de tec ted during fe rm enta tion.The m echanism of ac id-p roduing about LAB was d iscussed.The results ind ica ted the ac id-p roduing cap ab ility was d iffe rent am ong s ix LAB s tra ins,and the T M111-S s tra in showed quicke r ra te of ac id-p roduing,s lowe r ra te of dec lining in pH and lowe r pH a t the end of coagula tion.The ac id-p roduing cap ab ility of LAB was re la ted w ith the content ofβ-ga lac tos idase in bac te ria ce lls.Sc reening of exce llent LAB s tra ins would have imp ortant s ignificance for p roduing high qua lity yogurt and acce le ra ting indus tria liza tion effic iency.

yogurt;lac tic ac id bac te ria;ac id ity;β-ga lac tos idase

TS252.1

A

1002-0306(2010)01-0189-03

2009-02-27

馬春麗(1978-),女,博士研究生,研究方向:乳品科學(xué)。