唐遠(yuǎn)謀，焦士蓉，朱清華，唐鵬程，閔 甜

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039）

海藻酸鈉、卡拉膠聯(lián)合固定化木瓜蛋白酶特性研究

唐遠(yuǎn)謀，焦士蓉*，朱清華，唐鵬程，閔 甜

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039）

以海藻酸鈉、卡拉膠共混包埋制備固定化木瓜蛋白酶，并對(duì)木瓜蛋白酶固定化條件和固定化酶的部分性能進(jìn)行了探討。在海藻酸鈉濃度1.5%、卡拉膠濃度0.8%、木瓜蛋白酶濃度1.0%、氯化鈣濃度4.0%、固定化時(shí)間11h、固定化溫度為35℃、固定化pH7.5的條件下，可以獲得最佳的固定化效果，固定化酶活力回收率為56.27%。與游離酶相比，制備固定化酶的最適酶促反應(yīng)pH由7.0降至6.5，最適酶促反應(yīng)溫度由40℃升至50℃，其作用溫度范圍、pH范圍均比游離酶范圍寬。

木瓜蛋白酶，固定化酶，海藻酸鈉，卡拉膠

木瓜蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；海藻酸鈉、L－酪氨酸、干酪素 成都科龍化工試劑廠；卡拉膠 天津市博迪化工有限公司；其余試劑均為分析純。

SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，DHG－9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，HH－S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，電子天平，UV－2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，家用冷凍冷藏箱，WTL超微臺(tái)式離心機(jī)，酸度計(jì)（PHS－3C）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化木瓜蛋白酶的制備 參照文獻(xiàn)［5］的方法固定木瓜蛋白酶。在測(cè)定固定化木瓜蛋白酶活力之前將經(jīng)過(guò)一段時(shí)間硬化的固定化酶顆粒進(jìn)行抽濾，并在恒溫干燥箱中40℃下干燥1h后取出稱其總重m0。

1.2.2 酶活力的測(cè)定方法［6］取試管1：加入游離木瓜蛋白酶液1mL，pH7.5的磷酸鹽緩沖液3mL，40℃水保溫10min，精確加入40℃預(yù)熱的2%酪蛋白溶液5.0mL，混合均勻，立刻置于40℃水浴中，每隔5min振搖一次，反應(yīng)45min后，加入5.0mL的10%三氯乙酸，迅速搖勻終止反應(yīng)。

取試管2：同試管1的做法，改變酪蛋白和三氯乙酸的加入順序。

將上述試管溶液于3500r/min離心10min，分別取上清液。以試管2離心上清液作為試管1的參比，在波長(zhǎng)275nm處測(cè)定試管1的吸光度A。

酪氨酸對(duì)照液的測(cè)定：以0.2mol/L鹽酸溶液作參比，在波長(zhǎng)275nm處測(cè)定酪氨酸對(duì)照液的光吸收值A(chǔ)s。

酶活力的計(jì)算公式如下：

式中：A－試管1測(cè)定的光吸收值；As－酪氨酸對(duì)照液的光吸收值；C對(duì)照－酪氨酸的濃度（!g/mL）；M對(duì)照－酪氨酸的分子量（181.19）；V總－反應(yīng)總體積（mL）；V樣品－加入的樣液的體積（mL）；m樣品－加入的樣品的質(zhì)量（g）；t－反應(yīng)時(shí)間（min）；n－樣品的稀釋倍數(shù)。

酶活力的回收：

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 選取海藻酸鈉濃度、卡拉膠濃度、木瓜蛋白酶濃度、氯化鈣濃度、固定化時(shí)間、固定化溫度、固定化pH進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，逐一實(shí)驗(yàn)時(shí)固定其他6個(gè)條件，各選取不同的因子不同水平進(jìn)行固定化研究。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以海藻酸鈉濃度、固定化溫度、酶固定化pH、氯化鈣濃度，這4個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 木瓜蛋白酶游離酶和固定化酶的特性（最適酶促反應(yīng)pH和溫度）研究 在pH7.0的緩沖液中配制酶溶液，酶濃度為1.0%，所取反應(yīng)液為1.0mL，固定其他條件，在pH6.0～8.0、溫度20～60℃之間的磷酸緩沖液中分別測(cè)定固定化酶和游離酶的相對(duì)活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶最適固定化條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 海藻酸鈉濃度的確定 海藻酸鈉濃度不僅影響酶的固定率，還影響到膠珠的成型和反應(yīng)性能。濃度太低不能成珠；濃度過(guò)高擠珠困難，還會(huì)使得壁材過(guò)厚，降低靈敏度［7］。由表1可知，當(dāng)海藻酸鈉濃度為1.5%時(shí)，酶活力回收率最大。

表1 海藻酸鈉濃度對(duì)酶固定化的影響

2.1.2 卡拉膠濃度的確定 當(dāng)卡拉膠濃度較低時(shí)，固定化顆粒較小，較軟，當(dāng)增大到一定濃度時(shí)，固定化酶活力變化不大。由表2確定卡拉膠最適濃度為0.8%。

表2 卡拉膠濃度對(duì)酶固定化的影響

2.1.3 木瓜蛋白酶濃度的確定 從表3看出，當(dāng)酶濃度為1.0%時(shí)，制備的固定化酶活力達(dá)到最大值。

表3 木瓜蛋白酶濃度對(duì)酶固定化影響

2.1.4 氯化鈣濃度的確定 氯化鈣與海藻酸鈉反應(yīng)形成海藻酸鈣凝膠是包埋法固定化酶的一個(gè)重要過(guò)程，同時(shí)氯化鈣對(duì)形成凝膠的機(jī)械強(qiáng)度也有重要影響。由表4可知，最適氯化鈣濃度為4.0%。

表4 氯化鈣濃度對(duì)酶固定化的影響

2.1.5 固定化時(shí)間的確定 隨著固定化時(shí)間的增加，固定化酶相對(duì)活力呈上升趨勢(shì)，當(dāng)上升到一定程度便趨于穩(wěn)定。由表5可知，固定化時(shí)間為11h。

表5 固定化時(shí)間對(duì)酶固定化的影響

2.1.6 固定化溫度的確定 溫度增加時(shí)，酶在固定化過(guò)程中活力損失增加，由表6可知，最適固定化溫度為45℃。

表6 固定化溫度對(duì)酶固定化的影響

2.1.7 固定化pH的確定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7，得到最適固定化pH為7.0。

表7 固定化pH對(duì)酶固定化的影響

2.2 木瓜蛋白酶固定化的正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

由極差R可知，各因素對(duì)固定化酶活力回收率次序?yàn)椋篋＞C＞B＞A，溫度為主要因素，固定化最佳方案是A2B2C3D1，即海藻酸鈉濃度為1.5%，固定化溫度為35℃，固定化pH為7.5，氯化鈣溶液濃度為4.0%。以此條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，固定化酶活力回收率為56.27%。

2.3 木瓜蛋白酶游離酶和固定化酶的特性

2.3.1 最適酶促反應(yīng)pH 結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可得，固定化酶最適pH為6.5，游離酶的最適pH7.0，固定化酶比游離酶較耐酸，顯示出比游離酶更寬泛的pH適應(yīng)性，其原因可能是固定化載體維持了酶空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

圖1 最適酶促反應(yīng)pH

2.3.2 最適酶促反應(yīng)溫度 結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，固定化酶的最適溫度為50℃，比游離酶的最適溫度40℃高出10℃，且對(duì)于高溫有更好的穩(wěn)定性。這表明固定化提高了木瓜蛋白酶的熱穩(wěn)定性，分析原因可能是固定化載體提高了酶的空間結(jié)構(gòu)對(duì)熱的穩(wěn)定性。

圖2 最適酶促反應(yīng)溫度

3 結(jié)論

3.1 由單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)，得到最優(yōu)水平組合，即海藻酸鈉濃度1.5%、卡拉膠濃度0.8%、木瓜蛋白酶濃度1.0%、氯化鈣濃度4.0%、固定化時(shí)間為11h、固定化溫度為35℃、固定化pH為7.5，以此條件固定化木瓜蛋白酶，其酶活力回收率達(dá)56.27%。

3.2 探究固定化酶的特性與游離酶相比，得知固定化酶比游離酶較耐酸，顯示出比游離酶更寬泛的pH適應(yīng)性，且對(duì)于高溫有更好的穩(wěn)定性。

［1］乙引，張顯強(qiáng)，唐金剛，等.木瓜蛋白酶的純化和性質(zhì)［J］.貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，20（1）：11－14.

［2］Nitsawang S，Raini H K，Kanasawud P.Purification of pa－pare from carlca papaya latex：Aqueous two－phase extraction versus two－step salt precipitation［J］.Enzyme Microb Techn，2006，39（5）：1103－1106.

［3］李偉，孫建中，周其云.適用于酶包埋的高分子載體材料研究進(jìn)展［J］.功能高分子學(xué)報(bào)，2001，14（3）：365－369.

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［6］金鋒.微孔淀粉－海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶的研究［J］.中國(guó)釀造，2009（7）：83－85.

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Study on immobilized papain property with alginate and gum kala mixture

TANG Yuan－mou，JIAO Shi－rong*，ZHU Qing－h(huán)ua，TANG Peng－cheng，MIN Tian
（School of Bioengineering of Xihua University，Chengdu 610039，China）

Papain was immobilized by encapsulated in hydrogel beads prepared with alginate and gum kala，the immobilization conditions and partial properties of immobilized enzyme were investigated.The recovery of immobilized enzyme activity after 11h of immobilization at 35℃ and pH 7.5 was 56.27%，under the optimum operation conditions that the concentration of sodium alginate，gum kala，papain and CaCl2solution were 1.5%，0.8%，1.0%and 4.0%respectively.Compared with the free enzyme，the optimum pH value of immobilized papain decreased form 7.0 to 6.5，while the temperature increased from 40℃ to 50℃，which showed a wider range of reaction pH value and temperature than the free enzyme.The thermostability of immobilized papain was better than the free enzymes.

papain；immobilized enzyme；alginate；gum kala

TS201.2+5

A

1002－0306（2010）12－0209－03

木瓜蛋白酶（Papain，EC3.4.22.2）是從番木瓜中提取出的一種蛋白水解酶，具有強(qiáng)的蛋白水解活力，又含凝乳和溶菌活力，還具有脂解及蛋白合成功能，在輕紡、食品、醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用［1－2］。游離的木瓜蛋白酶穩(wěn)定性較差，并且使用后分離純化較困難，大大降低了其使用效率。固定化酶具有很好的穩(wěn)定性且易與底物、產(chǎn)物分離，從而提高了使用效率，正逐步受到人們的重視。海藻酸鈉、卡拉膠作為天然高分子材料因其安全、環(huán)保以及優(yōu)良的工藝性能，是食品酶工程中常用的包埋材料［3－4］。本文采用海藻酸鈉、卡拉膠聯(lián)合固定化木瓜蛋白酶，得到了最佳的固定條件并對(duì)固定化酶特性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2010－01－04 *通訊聯(lián)系人

唐遠(yuǎn)謀（1986－），男，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。