孫 潔，呂加平，劉 鷺，張書文

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193；2.農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計研究院，北京100125）

乳酸菌發(fā)酵劑菌體自溶及產(chǎn)酶特性

孫 潔1，2，呂加平1，*，劉 鷺1，張書文1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193；2.農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計研究院，北京100125）

使用自溶度不同的乳酸菌發(fā)酵劑來控制產(chǎn)品的成熟周期及感官風(fēng)味，具有良好的指導(dǎo)意義和實(shí)用價值，本文通過對嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和乳酸乳桿菌自溶度的研究表明，菌體自溶特性除了與菌株密切相關(guān)外，培養(yǎng)條件也會對其產(chǎn)生一定影響；在一定范圍內(nèi)，菌體自溶度隨培養(yǎng)溫度和pH的升高而增大，但超出這一范圍，過高的培養(yǎng)溫度和pH又會抑制菌體的自溶；乳酸菌自溶速度越快，產(chǎn)生并釋放的蛋白酶和脂肪酶酶活性達(dá)到峰值所需時間就越短；相同培養(yǎng)條件下，乳酸乳桿菌產(chǎn)脂肪酶酶活性最高，三個菌株（SY15、SY15－3、SY26）產(chǎn)酶活性達(dá)到24.11～46.23U；德氏乳桿菌保加利亞亞種產(chǎn)蛋白酶活性最高，四個菌株（LD1、LD1－3、LD3、LD3－3）產(chǎn)酶活性最低為27.63U（LD3－3）、最高為45.22U（LD1－3）。在乳酸菌發(fā)酵劑的使用過程中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要對自溶度不同的菌株進(jìn)行選擇。

乳酸菌，自溶，脂肪酶，蛋白酶

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試菌株 均來自于本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，經(jīng)APIOR試劑盒（生物－梅里埃公司，法國）鑒定，置信區(qū)間均在98%以上，分別為嗜熱鏈球菌（Streptococcus salivarius ssp.），標(biāo)記為GS1、GS2、GS3；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii ssp.Bulgaricus），標(biāo)記為 LD1、LD1－3、LD3、LD3－3；乳酸乳桿菌（Lactococcus lactis ssp.Lactis），標(biāo)記為SY15、SY15－3、SY26。菌株純化后用冷凍干燥機(jī)（LGJ－10中國北京四環(huán)）真空凍干成粉，保存于－80℃低溫冰箱，使用時經(jīng)由MRS肉湯培養(yǎng)基（中國北京陸橋）于37℃條件下培養(yǎng)活化3代，儲存于4℃冰箱備用。

1.2 菌株培養(yǎng)

活化菌株于MRS肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期，離心收集菌體細(xì)胞（4000r/min，10min），以無菌水洗滌兩次，離心收集菌體細(xì)胞備用。

1.3 不同溫度條件對菌株自溶的影響

將1.2中所得菌體細(xì)胞重懸于 PBS緩沖液（50mmol/L pH6.5）中，調(diào)整菌液吸光值（OD650nm）至1.0左右，分別置于4、10、25、37、45℃溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，于0、2、4、8、12、24h時取樣測定。

1.4 不同pH條件對菌株自溶的影響

將1.2中所得菌體細(xì)胞重懸于pH分別為4.5、5.5、6.5、7、7.5的PBS緩沖液（50mmol//L）中，置于37℃溫度條件下培養(yǎng)，其他條件同1.3，于0、2、4、8、12、24h時取樣測定。

1.5 菌體自溶度的檢測

將1.3和1.4中所得菌液置于石英杯中，使用分光光度儀（U－3010 Hitachi日本）測定其波長為650nm處的吸光度，自溶度計算公式如下［6］。

其中：A1為菌液吸光值；A2為菌液初始吸光值［7］。

1.6 蛋白酶活性的測定

其中：ΔA為樣品與空白對照的吸光值之差；K為吸光常數(shù)；n為反應(yīng)總體積；t為反應(yīng)時間。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)中酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1所示）確定K=76.89。

1.7 脂肪酶活的測定

脂肪酶活的測定采用堿滴定法［9］，略有改進(jìn)：將4%聚乙烯醇與化學(xué)純級橄欖油按3∶1的比例混合，冷卻至4℃后用組織搗碎機(jī)乳化10min，使其成為乳白、分散均勻的底物乳化液，冰箱保存?zhèn)溆?。測定時將5mL磷酸緩沖液（0.025mol/L，pH 7.5）和4mL上述乳化底物置于100mL三角瓶中混合，于40℃水浴5min；然后加入1mL待測菌液搖勻繼續(xù)水浴，精確計時15min，立即向三角瓶內(nèi)加入95%乙醇15mL以終止反應(yīng)；向三角瓶內(nèi)滴加1%酚酞指示劑1～2滴，使用微量滴定管，用0.01mol/L的NaOH溶液滴定至微紅色，記錄耗堿量；以未加菌液的體系滴定值設(shè)置空白對照。酶活力定義為：在40℃、pH 7.5的條件下，脂肪酶每分鐘分解脂肪產(chǎn)生1μmol游離脂肪酸所需要的酶量（單位）定義為一個脂肪酶酶活性單位U。計算公式為：

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

式中：A為NaOH消耗量；B為空白對照組NaOH消耗量；t為反應(yīng)時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的自溶特性

2.1.1 不同菌株間自溶度差異 在37℃條件下將各菌株懸浮于PBS緩沖液（50mmol/L pH6.5）中孵育，不同時間取樣測定菌株自溶度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同菌株在相同環(huán)境中的自溶度差異

不同菌種的自溶度有很大差異，在pH 6.5、37℃條件下培養(yǎng)24h，德氏乳桿菌保加利亞亞種的自溶度最大，其四個菌株的自溶度分別在42%～61%之間；乳酸乳桿菌的自溶程度最小，三個菌株的自溶度均在11%以下，其中菌株SY15在24h之內(nèi)幾乎沒有發(fā)生自溶。同種乳酸菌的不同菌株之間自溶度也有一定差異，例如嗜熱鏈球菌三個菌株的自溶度分別為20.8%（GS2）、6.8%（GS1）和9.6%（GS3）。

2.1.2 培養(yǎng)溫度對乳酸菌自溶的影響 培養(yǎng)溫度對乳酸菌的自溶有較大影響，以桿菌LD1－3和球菌GS2為例，結(jié)果如圖3所示。

在4℃和15℃的低溫條件下，乳酸菌的生長基本處于停滯狀態(tài)，此時菌體的自溶度也降至最低。在25～42℃范圍內(nèi)，乳酸菌的自溶程度明顯隨環(huán)境溫度的升高而增大，菌株LD1－3和GS2在42℃條件下孵育24h，較25℃條件下的自溶度分別提高了43.6%和41.5%。較高的環(huán)境溫度對桿菌LD1－3自溶的促進(jìn)作用比對球菌GS2更明顯。在高溫環(huán)境中，乳酸菌的自溶呈現(xiàn)一種先揚(yáng)后抑的趨勢，在孵育初期，55℃條件下菌株自溶度比42℃條件下高，孵育后期前者的自溶度又開始低于后者?？梢娺^高或過低的培養(yǎng)溫度，都因其不利于菌體生長而影響了菌體自溶酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，或抑制其活性，從而降低了菌體的自溶程度。

2.1.3 環(huán)境酸度對乳酸菌自溶的影響 乳酸菌培養(yǎng)的環(huán)境pH對菌體的自溶也有一定影響，圖4所示為菌株LD1與GS2在不同pH條件下孵育的自溶情況。

(2)改革工藝，減少產(chǎn)塵量。選煤廠適當(dāng)提高入選上限，減少煤的破碎量，或適當(dāng)調(diào)整破碎機(jī)的工藝參數(shù)，盡量減少過粉碎，均可大大減少煤塵數(shù)量。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對菌株自溶的影響

圖4 不同環(huán)境pH對菌株自溶的影響

關(guān)于環(huán)境酸度對乳酸菌自溶的影響的研究結(jié)論不盡相同，Tetsuya等學(xué)者［5］認(rèn)為乳酸菌在低pH條件時自溶程度較大；但是李艾黎等［10］的研究又認(rèn)為較低的pH會抑制菌體的自溶。

本研究發(fā)現(xiàn)：較高的pH更有利于菌體的自溶，尤其是在菌體培養(yǎng)初期（0～8h），pH的升高可顯著增大菌體自溶程度，例如菌株LD1在pH4.5的條件下培養(yǎng)24h，其自溶度為18.8%；當(dāng)pH升至7時，自溶度則達(dá)到了46.3%；同樣，菌株GS2在pH4.5與pH7條件孵育的自溶度分別為9.4%與25.5%，二者均有一倍左右的增長。但是當(dāng)pH繼續(xù)增大時，這種趨勢又發(fā)生了改變：在pH7.5孵育時，菌株LD1和GS2的自溶程度都較pH7時有所降低，這一趨勢在其他菌株實(shí)驗(yàn)中均有體現(xiàn)。由于乳酸菌的自溶是一種自發(fā)的生理過程，這一過程受很多因素影響，有著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，不同菌株的自溶行為對環(huán)境酸度的敏感度不同，同時還可能與培養(yǎng)時所用緩沖液的種類、濃度及其他環(huán)境因素有一定關(guān)系，因此才出現(xiàn)pH對自溶影響結(jié)果的矛盾報道。

通過上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在37℃、pH 6.5環(huán)境條件下，大多數(shù)乳酸菌的自溶程度都處于一個中間、穩(wěn)定的狀態(tài)，因此也將其確定為下一步實(shí)驗(yàn)的孵育條件。

2.2 乳酸菌產(chǎn)生脂肪酶的活性與自溶度的關(guān)系

不同乳酸菌產(chǎn)生脂肪酶的活性如圖5所示。

圖5 不同乳酸菌產(chǎn)生的脂肪酶酶活性

在培養(yǎng)過程中，不同乳酸菌產(chǎn)生脂肪酶活性的峰值以及到達(dá)峰值的時間都有很大差別，由圖5可見，乳酸乳桿菌的脂肪酶活性最高，三個菌株產(chǎn)酶的酶活在24.11～46.23U范圍內(nèi)；德氏乳桿菌保加利亞亞種產(chǎn)脂肪酶的活性最低，在15.12～18.17U范圍內(nèi)；嗜熱鏈球菌的脂肪酶活性基本上在26U左右，雖然實(shí)驗(yàn)菌株自溶程度并不相同，但其產(chǎn)生脂肪酶的酶活峰值卻十分相近。圖6中所示即為嗜熱鏈球菌三菌株在自溶期間脂肪酶活性的變化。圖中可見，在37℃、pH 6.5條件下，三個菌株的脂肪酶活性隨著培養(yǎng)時間的推移而逐步增大，達(dá)到峰值后又有一定程度的下降。乳酸菌產(chǎn)脂肪酶酶活性到達(dá)峰值的時間與菌株的自溶度有一定相關(guān)性，菌株GS1、GS2和GS3在孵育24h后的自溶度分別為6.8%、20.8%和9.6%，由圖中可知，自溶度較大的菌株GS2，其脂肪酶活性達(dá)到峰值所需時間比自溶度小的菌株GS1、GS3所需時間短。

圖6 不同嗜熱鏈球菌菌株自溶期間脂肪酶活性的變化

2.3 不同乳酸菌產(chǎn)生蛋白酶活性與自溶度的關(guān)系

不同乳酸菌產(chǎn)生蛋白酶的活性如圖7所示。

圖7 不同乳酸菌產(chǎn)生的蛋白酶酶活性

由圖7可知，德氏乳桿菌保加利亞亞種產(chǎn)蛋白酶的酶活性遠(yuǎn)高于其余兩種乳酸菌，其中3個菌株的酶活性均在40～46U之間；嗜熱鏈球菌產(chǎn)蛋白酶的活性在12.66～15.23U之間；乳酸乳桿菌的脂肪酶活性最高，但其蛋白酶的活性卻最低，均在7.63～10.11U之間。圖8中所示為GS1、GS2和GS3在自溶期間蛋白酶活性的變化情況。由圖中可見，在37℃、pH6.5條件下，三個菌株的蛋白酶活性隨孵育時間的推移而逐步增大，達(dá)到峰值之后又開始下降。自溶度高的菌株GS2產(chǎn)蛋白酶酶活到達(dá)峰值的時間約為36h左右，而自溶度較低的菌株GS1約為45h左右。

圖8 不同菌株嗜熱鏈球菌自溶期間蛋白酶活性變化

3 結(jié)論

不同菌種或菌株其自溶程度不同，同時菌株的生長環(huán)境對自溶也有一定影響：過高或者過低的培養(yǎng)溫度和pH都可抑制乳酸菌的自溶，每種乳酸菌都存在一個最適宜的培養(yǎng)條件，在該條件下菌體繁殖最穩(wěn)定。通常在高于45℃的培養(yǎng)條件下，菌體在對數(shù)生長期因自溶過快會導(dǎo)致活菌數(shù)急劇下降，不利于乳酸菌的增殖；在4～10℃低溫條件下，菌體幾乎不發(fā)生自溶。培養(yǎng)環(huán)境pH的升高也會增大菌體的自溶程度，過酸的環(huán)境則會抑制菌體自溶。

相同培養(yǎng)條件下，乳酸乳桿菌產(chǎn)脂肪酶活性最高，嗜熱鏈球菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種次之，而產(chǎn)蛋白酶活性最高的是德氏乳桿菌保加利亞亞種，嗜熱鏈球菌與乳酸乳桿菌次之。乳酸菌產(chǎn)生的脂肪酶和蛋白酶活性變化與菌株自溶程度有密切的關(guān)系，自溶度越大的菌株產(chǎn)酶活性到達(dá)峰值的時間越短。所以在乳酸菌發(fā)酵劑的選擇過程中，應(yīng)根據(jù)所需目的的不同，針對各種目標(biāo)菌群進(jìn)行分析，找到最適合的培養(yǎng)條件，或者通過添加自溶度不同的菌株來加速或降低發(fā)酵劑的自溶程度，從而達(dá)到生產(chǎn)所需的目的，使之成為適合工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)良發(fā)酵劑。

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Lipase and protease activities and autolysis properties of lactic acid bacteria

SUN Jie1，2，LV Jia－ping1，*，LIU Lu1，ZHANG Shu－wen1
（1.Institute of Agro－food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Lab of Agricultural Product Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture，Beijing 100193，China；2.Chinese Academy of Agricultural Engineering，Beijing 100125，China）

The autolysis properties of lactic acid bacteria are crucial for their applications as dairy starters.The autolysis rate of S.salivarius ssp.，L.delbrueckii ssp.Bulgaricus and L.lactis ssp.Lactis were determined under various conditions of incubated temperature and pH values，as these factors were closely related to cell viability and flavor development in the products.Autolysis increased when temperature and pH values were rising in a certain range.Over the range，higher or lower temperature and pH value would inhibit the autolysis rate of strains. Lipase and protease activities were closely related to the sort of strains.Time of reaching the highest activities for lipase and protease depended on the autolytic degree of strains.All L.lactis ssp.Lactis strains showed higher lipase activities，and protease activities in L.delbrueckii ssp.Bulgaricus were mostly higher than other strains.These properties should be considered when commercial starters were selected.

lactic acid bacteria；autolysis；lipase；protease

TS201.3

A

1002－0306（2010）12－0164－04

乳酸菌以其優(yōu)良的發(fā)酵特性及益生功能在化工及食品工業(yè)中的地位毋庸置疑，近年來大量文獻(xiàn)報道了通過優(yōu)化發(fā)酵工藝來有效增加乳酸菌活菌數(shù)，此外通過基因調(diào)控等方式改善乳酸菌在生產(chǎn)過程及產(chǎn)品中的生長狀態(tài)也成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。乳酸菌自溶（Autolysis）是指在一定的條件下，菌體細(xì)胞自身釋放某些酶類水解細(xì)胞壁肽聚糖的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致其裂解，胞內(nèi)物質(zhì)向周圍環(huán)境釋放的過程［1］，這些酶類被稱之為自溶酶（autolysin）。關(guān)于細(xì)菌自溶的確切機(jī)制尚不清楚，但可以肯定的是，自溶是細(xì)胞在生長過程中不可或缺的正?，F(xiàn)象［2］。乳酸菌的自溶特性對發(fā)酵乳制品品質(zhì)影響較大，以干酪為例，發(fā)酵劑乳酸菌的快速自溶不僅可縮短成熟周期、降低生產(chǎn)成本，而且菌體自溶后釋放的多種蛋白酶類和脂肪酶，又決定著干酪風(fēng)味及感官特性［3－5］。同樣在酸奶制作中，發(fā)酵劑菌株的自溶不但影響酸奶風(fēng)味和感官品質(zhì)，也會造成活菌數(shù)下降、酸奶保健功能降低等負(fù)面影響。但適度的自溶又可減少酸奶后酸化及改善風(fēng)味。所以，研究乳酸菌自溶特性及菌株在自溶期間釋放的主要酶活性變化規(guī)律，對改進(jìn)干酪和酸奶品質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義。本文以發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中最常用的三種乳酸菌為研究對象，通過比較不同菌株的自溶規(guī)律及其菌體釋放的蛋白酶與脂肪酶酶活性變化，初步探討自溶程度的影響因素及菌體脂肪酶與蛋白酶活性變化與自溶度的相關(guān)關(guān)系。

2009－11－23 *通訊聯(lián)系人

孫潔（1980－），女，博士，研究方向：食品微生物與乳品加工。

國家科技部“十一五”奶業(yè)產(chǎn)業(yè)化支撐計劃（2006BAD04A07，2006BAD04A10）。