樓喬明，叢培旭，徐 杰，薛長湖

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

尿素包合法純化孔石莼不飽和脂肪酸

樓喬明，叢培旭，徐 杰，薛長湖*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

用Folch法提取孔石莼總脂，經(jīng)皂化后酸化制得脂肪酸，再對脂肪酸進(jìn)行尿素包合，使其中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸分離，從而提高不飽和脂肪酸的含量。在脂肪酸∶尿素∶無水乙醇比為1∶2∶20，溫度為4℃，包合12h的條件下進(jìn)行尿素包合結(jié)晶，效果較好，不飽和脂肪酸含量由72.43%增加到96.91%，其中十六碳四烯酸由13.63%增加到22.92%，增加68.16%，十八碳四烯酸由20.99%增加到38.82%，增加84.95%。

孔石莼，尿素包合，純化，不飽和脂肪酸

孔石莼（Ulva pertusa Kjellm）屬于綠藻門石莼科石莼屬，是一種大型綠藻，俗稱海菠菜、海白菜等，廣泛分布于西太平洋沿海，是我國野生經(jīng)濟(jì)藻類中資源極為豐富的一種［1］。自古以來孔石莼在食用和藥用方面就有廣泛的應(yīng)用。明朝李時珍的《本草綱目》中有“下水、利小便”之功效記載?？资恢舅嶂泻写罅康氖妓南┧幔–16∶4）、十八碳三烯酸（C18∶3）、十八碳四烯酸（C18∶4）等多不飽和脂肪酸［2］，而這些多不飽和脂肪酸都可以作為二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）的合成前體［3－4］。但是，當(dāng)前對孔石莼的利用還相當(dāng)有限，除了少量食用和藥用外，僅有一些作為飼料和肥料，對其藥用等價值也尚未得到充分開發(fā)［5］。本文通過尿素包合法對孔石莼的不飽和脂肪酸，尤其是十六碳四烯酸和十八碳四烯酸進(jìn)行純化，為孔石莼資源的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、三氯甲烷、正己烷、石油醚、尿素（分析純）等 由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

6980N型氣相色譜儀 美國 Agilent公司；Laborota 4000 efficient旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 德國海道爾夫公司；AB135－S型精密電子分析天平 瑞士梅特勒－托利多公司；Milli－Q Synthesis超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

孔石莼于2009年11月采自青島棧橋附近海域，自來水清洗，除去泥沙和其他雜草；樣品冷風(fēng)吹干，室溫保存。

1.2.1 總脂提取 取一定量的孔石莼，粉碎，按1∶20（m∶v）的量加入氯仿－甲醇（2∶1，v∶v）混合液，超聲30min，然后浸提24h。過濾后，浸提液用0.9%氯化鈉溶液洗滌，倒入分液漏斗中靜置分層。下層（氯仿層，墨綠色）用無水硫酸鈉干燥后，蒸發(fā)濃縮，得到墨綠色浸膏。

1.2.2 混合脂肪酸的制備 所提浸膏用 1mol/L KOH－乙醇溶液100mL，于70℃水浴加熱回流，皂化2h。皂化液冷卻至室溫后，加入適量水使皂化液完全溶解，用30mL石油醚萃取3次，棄去醚層，除去不皂化物。水層用10%鹽酸酸化至pH1～2，靜置分層，石油醚萃取有機(jī)相3次，合并石油醚并用水洗至中性，無水硫酸鈉干燥，減壓旋轉(zhuǎn)蒸干，得混合脂肪酸。

1.2.3 尿素包合 將上述所得的混合脂肪酸，按脂尿比（1∶2）［6］、尿素乙醇比（1∶10）進(jìn)行實驗。將尿素于70℃水浴中回流溶解，加入制備的混合脂肪酸，攪拌冷卻至室溫，于4℃包合結(jié)晶12h。結(jié)晶后，加入活性炭攪拌脫色10min，并進(jìn)行抽濾，所得濾液加入等體積水和兩倍體積的氯仿進(jìn)行萃取，氯仿層用無水硫酸鈉干燥，蒸干濾液，得脂肪酸。

1.2.4 脂肪酸甲酯化 取一定量樣品，加入1mL 2mol/L HCl－甲醇溶液，于60℃水浴中甲酯化15min，冷卻后加入正己烷和飽和氯化鈉溶液各1mL振蕩，靜置分層，取上清液供氣相分析。

1.2.5 氣相色譜分析 HP－INNOWax石英毛細(xì)管柱（30m×0.32mm），高純氮氣為載氣，采用恒壓模式，壓力為 7.81psi，分流比為 25∶1。進(jìn)樣口溫度為230℃，檢測器溫度為250℃，柱溫以3℃/s由170℃升到210℃，然后在210℃下保持10min，最后對各組分峰用面積歸一法進(jìn)行積分，得出各組分的百分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 尿素包合條件

尿素包合法是純化不飽和脂肪酸的一種有效方法。尿素分子在結(jié)晶過程中能夠與飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸形成穩(wěn)定的晶體包合物析出，而多不飽和脂肪酸由于雙鍵較多，碳鏈彎曲，具有一定的空間構(gòu)型，不易被尿素包合［7］。在尿素包合過程中，對不飽和脂肪酸富集效果影響最大的因素是尿素用量，如果尿素量過少，對飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸的包合程度就會下降，達(dá)不到理想效果；同時尿素量過多時，尿素物理攜帶的不飽和脂肪酸越多，導(dǎo)致富集得率降低。而溶劑乙醇的用量、尿素包合溫度和時間對不飽和脂肪酸富集效果影響不大［6，8］；但增加乙醇用量有利于后續(xù)活性炭脫色。因此本實驗在脂尿比（1∶2）、尿素乙醇比（1∶10），4℃包合12h下進(jìn)行操作。

通過皂化后酸化所得的混合脂肪酸含有大量的色素。在尿素包合結(jié)晶后，加入活性炭進(jìn)行脫色。過濾除去結(jié)晶的尿素和活性炭。加入等體積水和兩倍體積的氯仿，以萃取不飽和脂肪酸和除去乙醇中未結(jié)晶的尿素。氯仿層用無水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮，最后得到淡黃色脂肪酸液體。

2.2 尿素包合前后脂肪酸分析

圖1 尿素包合前孔石莼脂肪酸氣相色譜圖

尿素包合前后脂肪酸的氣相色譜圖見圖1、圖2，脂肪酸分析結(jié)果見表1。結(jié)果表明：尿素包合前，孔石莼中飽和脂肪酸含量為27.57%，主要為棕櫚酸（24.84%）和月桂酸（2.73%）；不飽和脂肪酸含量為72.43%，主要為十八碳四烯酸（20.99%）、十六碳四烯酸（13.63%）、十八碳三烯酸（13.56%）等多不飽和脂肪酸。尿素包合后，不飽和脂肪酸含量增加到96.91%，多不飽和脂肪酸含量由 52.15%增加到85.44%，增加63.84%，其中十六碳四烯酸由13.63%增加到 22.92%，增加 68.16%；十八碳四烯酸由20.99%增加到38.82%，增加84.95%。綜合分析結(jié)果，按脂尿比（1∶2）、尿素乙醇比（1∶10），4℃包合12h條件進(jìn)行尿素包合結(jié)晶，對飽和脂肪酸具有較好的包合作用，達(dá)到孔石莼不飽和脂肪酸的富集純化效果。

圖2 尿素包合后孔石莼脂肪酸氣相色譜圖

表1 尿素包合前后孔石莼脂肪酸相對含量

3 結(jié)論

3.1 尿素包合法是富集純化孔石莼不飽和脂肪酸的一種有效方法，具有簡便、經(jīng)濟(jì)、高效等特點，所用試劑簡單易得，且均可回收，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2 通過尿素包合后，不飽和脂肪酸的含量由72.43%增加到96.91%，達(dá)到了對孔石莼不飽和脂肪酸富集純化的目的。

［1］王艷梅，李志恩，徐祖洪.孔石莼化學(xué)組分和藥用活性研究進(jìn)展［J］.海洋科學(xué)，2000，24（3）：1－2.

［2］吳志軍，熊慧萍，李智恩，等.孔石莼脂溶性化學(xué)成分的分析［J］.海洋科學(xué)，2000，24（5）：3－4.

［3］張樂，蒲新明，梁彥娟，等.必需脂肪酸在海洋食物鏈中的作用［J］.海洋科學(xué)，2009，33（4）：66－71.

［4］Hazzard S E，Kleppel G S.Egg production of the copepod acartia tonsa in Florida Bay：role of fatty acids in the nutritional composition of the food environment［J］.Mar Ecol Prog Ser，2003，252：199－206.

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［7］蔣艷忠.尿素包合法分離蠶蛹油中多不飽和脂肪酸［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2008，20（3）：363－366.

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Purification of unsaturated fatty acids from Ulva pertusa Kjellm by urea adduction

LOU Qiao－ming，CONG Pei－xu，XU Jie，XUE Chang－h(huán)u*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The total lipid of Ulva pertusa Kjellm was extracted using Folch method，saponificated and acidificated to obtain the fatty acids.The saturated fatty acids and unsaturated fatty acids were separated by the method of urea adduction，thus improved the content of unsaturated fatty acids.The results of the experiment were preferable at the ration of fatty acids，urea and ethano（l1∶2∶20），temperature（4℃），adduction time（12h）.The content of unsaturated fatty acids was raised from 72.43%to 96.91%，and content of hexadecatetraenoic acid raised from 13.63%to 22.92%，stearidonic acid from 20.99%to 38.82%，and increased 68.16%and 84.95%，respectively.

Ulva pertusa Kjellm；urea adduction；purification；unsaturated fatty acids

TS254.1

A

1002－0306（2010）12－0160－02

2009－12－28 *通訊聯(lián)系人

樓喬明（1981－），男，博士研究生，研究方向：海洋活性物質(zhì)研究。

國家科技支撐計劃（2008BAD94B04）。