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華根霉脂肪酶催化合成乙酸香茅酯的研究

2010-11-02 13:56:22周藝博
食品工業(yè)科技 2010年2期
關(guān)鍵詞:香茅醇酸活度

王 楠,王 棟,徐 巖,周藝博

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

華根霉脂肪酶催化合成乙酸香茅酯的研究

王 楠,王 棟,徐 巖*,周藝博

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

研究了華根霉菌絲結(jié)合脂肪酶(RCL)非水相直接酯化合成乙酸香茅酯的反應(yīng)條件。在醇酸比為 1.2∶1,反應(yīng)溫度 40℃時(shí)得到較高的轉(zhuǎn)化率。但由于底物乙酸較強(qiáng)的抑制性,使得高底物濃度下 RCL催化能力受限。通過(guò)采用分批流加的方法使在底物濃度 0.2mol/L時(shí)轉(zhuǎn)化率提高至 94%。與 10種商品化脂肪酶進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)在相同條件下RCL表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)化效率。產(chǎn)物乙酸香茅酯的色澤好,氣味純正。

華根霉,菌絲結(jié)合脂肪酶,乙酸香茅酯,非水相體系

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

香茅醇、乙酸香茅酯的標(biāo)準(zhǔn)品 色譜純,均購(gòu)于Sigma公司;Lipozyme IM、南極假絲酵母 Candida antarctic脂肪酶 (CAL,即 N ovozym435) 購(gòu)自 Novo Nordisk公司;玫瑰假絲酵母 Candida rugosa脂肪酶(CRL)、豬胰 Porcine pancreas脂肪酶 (PPL) 購(gòu)自Sigma公司;熒光假單胞菌 Pseudom onas fluorescens脂肪酶 (AK)、青霉 Penicillium cam em berti脂肪酶 (G)、洋蔥假單胞菌 Pseudom onas cepacia脂肪酶 (PS)、固定與硅藻土的洋蔥假單胞菌脂肪酶 (PS-D)、爪哇曲霉 Aspergillus javanicus脂肪酶 (F-AP15) 購(gòu)自Amano Phar maceutical公司;華根霉 Rhizopus chinensis CCTCC M201021菌絲結(jié)合脂肪酶(RCL)的制備見(jiàn)文獻(xiàn)[8];其他試劑 均為分析純。

1.2 脂肪酶合成活性的測(cè)定

分別取濃度為 1.2mol/L的辛酸和乙醇的庚烷溶液 0.5mL到 5mL離心管中,混合均勻后加入 10mg干菌體,在 40℃空氣振蕩器中反應(yīng) 30min,反應(yīng)結(jié)束后立即離心去除菌體,然后從上層清液中吸取 400μL反應(yīng)液并加入 100μL內(nèi)標(biāo) (己醇),氣相檢測(cè)生成的辛酸乙酯。氣相柱為 PEG20000,檢測(cè)器為 F ID,采用程序升溫,起始溫度 90℃維持 5min,以 10℃/min速率升溫 11min,最終溫度 200℃,保留時(shí)間 5min。在此條件下,1min生成 1μmol的辛酸乙酯所需的酶量定義為 1個(gè)合成酶活力單位。

1.3 水活度的控制

初始水活度平衡方法按徐巖等人的報(bào)道[6]。有機(jī)溶劑(包括反應(yīng)的酸和醇)和 RCL均在 25℃密閉的容器內(nèi)用飽和鹽溶液平衡 3d。所采用的鹽為L(zhǎng)iCl (aw=0.113)、MgCl2(aw=0.30)、Mg(NO3)2(aw= 0.529)、NaNO3(aw=0.66)、NaCl(aw=0.75)和 K2SO4(aw=0.97)。

1.4 非水相酶促合成乙酸香茅酯反應(yīng)

取 0.05mol/L香茅醇和等摩爾量的乙酸,置于磨口錐形瓶?jī)?nèi),加入 10mL庚烷和脂肪酶。密閉后,置于恒溫空氣搖床上 200r/min反應(yīng)。

定時(shí)從反應(yīng)液中取 0.2mL,離心 (8000r/min 10min)取上清 0.1mL加入等體積 0.05mol/L正己醇作為內(nèi)標(biāo)。

1.5 乙酸香茅酯的檢測(cè)

產(chǎn)物酯分析采用的氣相色譜條件為:Agilent 6820氣相色譜儀,采用 PEG 20M(AC20)毛細(xì)色譜柱(30m×0.22mm),載氣為 N2;程序升溫,100℃保持1min,升溫速率 10℃/min至 200℃保持 3min。

乙酸香茅酯的轉(zhuǎn)化率 C(%)=測(cè)得的乙酸香茅酯含量/完全酯化的乙酸香茅酯含量 ×100%

1.6 紅外光譜分析

用 FT-I R SPECTROMETER紅外光譜儀鑒定產(chǎn)品乙酸香茅酯的結(jié)構(gòu),制樣方法采用液膜法。在400~4000cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.7 產(chǎn)品品質(zhì)鑒定

相對(duì)密度的檢測(cè)方法:按照QB 796“香料統(tǒng)一檢查方法——比重測(cè)定”;酸度的檢測(cè)方法:按照QB 806“香料統(tǒng)一檢查方法——酸值測(cè)定”;折光指數(shù)的檢測(cè)方法:按照QB 798“香料統(tǒng)一檢查方法——折光指數(shù)測(cè)定”。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶加量對(duì)華根霉脂肪酶合成乙酸香茅酯的影響

首先考察了酶加量對(duì)催化合成乙酸香茅酯的影響。通常在一定范圍內(nèi)酶濃度越大,酶與底物接觸的幾率越大,催化反應(yīng)速度越快。如圖 1所示,隨著加酶量增加,從 30U/mL到 120U/mL,乙酸香茅酯的轉(zhuǎn)化率幾乎呈線性增長(zhǎng),由 43%增加至 80.1%。這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛却笥诿噶繒r(shí),隨著酶量的增加,底物與酶形成酶-底物復(fù)合物量也逐漸增加,這種過(guò)渡態(tài)可迅速轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。但隨著酶加入量繼續(xù)增加,轉(zhuǎn)化率趨于平緩,無(wú)法進(jìn)一步得到有效的提高??紤]產(chǎn)率和經(jīng)濟(jì)效益兩方面因素,選定最適酶加量為120U/mL。

圖 1 酶加量對(duì) RCL合成乙酸香茅酯的影響

2.2 水活度對(duì)華根霉脂肪酶合成乙酸香茅酯的影響

在非水相催化研究中,一般認(rèn)為初始水活度也是影響脂肪酶催化的一個(gè)重要因素。只有達(dá)到最佳水含量時(shí),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)剛性和熱力學(xué)穩(wěn)定性之間才能達(dá)到最佳平衡點(diǎn)[9]。為此考察了不同初始水活度對(duì) RCL合成乙酸香茅酯的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖 2 初始水活度對(duì)RCL合成乙酸香茅酯的影響

從圖 2中可以看出,初始水活度對(duì)催化效果影響不是特別顯著,初始水活度范圍在 0.01~0.66之間時(shí)雖然轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢(shì),但 RCL均表現(xiàn)了較高的催化效率,從中可以看出,RCL可以耐受較為寬泛的水活度范圍。Gandolfi等人也報(bào)道了菌絲結(jié)合脂肪酶在酯化反應(yīng)中對(duì)水的存在表現(xiàn)的不是特別敏感[10]。但當(dāng)初始水活度超過(guò)臨界值時(shí),轉(zhuǎn)化率有較為明顯的下降。這可能是由于水的過(guò)量存在有利于全細(xì)胞內(nèi)水解酶催化從而影響反應(yīng)平衡。

2.3 醇酸比對(duì)華根霉脂肪酶合成乙酸香茅酯的影響

通常優(yōu)化底物摩爾比對(duì)轉(zhuǎn)化率的提高是一個(gè)有效的策略[11]。實(shí)驗(yàn)考察了不同底物摩爾比對(duì)RCL催化合成乙酸香茅酯的影響,反應(yīng)體系固定乙酸的量,將其和香茅醇按照一定摩爾比混合后加入反應(yīng)體系中,結(jié)果如圖 3所示。

圖 3 不同醇酸比對(duì)RCL合成乙酸香茅酯的影響

開(kāi)始時(shí),隨著醇酸摩爾比的加大,乙酸香茅酯的轉(zhuǎn)化率明顯增大。在醇酸比升高至 1.2∶1時(shí),轉(zhuǎn)化率由之前的 80.1%提高至 99.5%。其原因主要是酯化反應(yīng)是可逆反應(yīng),過(guò)量香茅醇的存在有利于推動(dòng)反應(yīng)平衡向著酯合成方向移動(dòng),從而提高乙酸香茅酯的產(chǎn)率。但隨著醇酸摩爾比的進(jìn)一步增加,轉(zhuǎn)化率及反應(yīng)速率呈現(xiàn)下降趨勢(shì),原因可能是醇分子通過(guò)其疏水性側(cè)鏈與脂肪酶活性中心周?chē)姆菢O性氨基酸相互作用,引起酶構(gòu)象的局部改變,不利于其與酸分子結(jié)合。所以綜合考慮我們采用 1.2∶1作為最佳醇酸比。

2.4 分批添加底物酸對(duì)較高底物濃度下合成乙酸香茅酯的影響

為了進(jìn)一步考察 RCL工業(yè)化應(yīng)用前景,使下一階段的提取分離更為有效。在一定的菌體量條件下,考察了增加底物濃度對(duì)酯化反應(yīng)的研究。當(dāng)反應(yīng)體系中乙酸含量較高時(shí),作為合成反應(yīng)的底物乙酸的極性較強(qiáng)(log P=0.5),在底物濃度為 0.2mol/L時(shí)轉(zhuǎn)化率大幅降低,只有 24%。為降低高濃度乙酸對(duì) RCL的毒害作用。實(shí)驗(yàn)采用分批流加乙酸的方式完成酯化反應(yīng),在反應(yīng)第一步轉(zhuǎn)化率接近平衡時(shí)第二次添加底物乙酸,使得反應(yīng)過(guò)程中乙酸濃度一直保持在較低的范圍內(nèi),避免在反應(yīng)過(guò)程中引起酶的失活。從圖 4中可以看出,通過(guò)采用批次添加底物法使得在初速度較快,考慮原因是由于醇酸比高引起。最終轉(zhuǎn)化率可達(dá)到 93.7%,在高底物濃度下有效提高了轉(zhuǎn)化率。

圖 4 分批次添加乙酸對(duì) RCL合成乙酸香茅酯的影響

2.5 反應(yīng)批次對(duì)華根霉脂肪酶合成乙酸香茅酯的影響

按照上述的優(yōu)化條件,考察了 RCL催化合成乙酸香茅酯的重復(fù)使用情況。在第二批反應(yīng)時(shí)酶活受到一定影響,接下來(lái) 5批次反應(yīng)后乙酸香茅酯的產(chǎn)率仍可達(dá) 80%左右,說(shuō)明多次重復(fù)使用后,RCL仍能保持較好的活性,整個(gè)反應(yīng)體系在上述的優(yōu)化條件下有較好的操作穩(wěn)定性。

圖5 RCL合成乙酸香茅酯的批次穩(wěn)定性

2.6 華根霉脂肪酶與商品化脂肪酶合成乙酸香茅酯的比較

對(duì)具有相同酯合成酶活力單位的商品化脂肪酶和 RCL在相同的反應(yīng)體系下對(duì)乙酸香茅酯的轉(zhuǎn)化效果進(jìn)行了研究,結(jié)果如表 1所示。

表 1 不同脂肪酶催化合成乙酸香茅酯的效果比較

從表 1中可以看出:脂肪酶的來(lái)源不同,其催化活性也不同。其中Novozym 435的轉(zhuǎn)化效果最佳,最終轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到 95.1%,其次是 RCL,其轉(zhuǎn)化效果與Novozym 435相差不大,轉(zhuǎn)化率接近94%??紤]到RCL作為菌絲結(jié)合脂肪酶省去了復(fù)雜的純酶提取與固定化等工藝,除了具有較高的轉(zhuǎn)化率之外,在成本價(jià)格上與商品化脂肪酶相比具有一定的優(yōu)勢(shì),所以RCL有利于酶法生產(chǎn)乙酸香茅酯工業(yè)化的應(yīng)用。

2.7 產(chǎn)物表征分析與品質(zhì)鑒定

2.7.1 產(chǎn)物紅外光譜鑒定 將經(jīng)過(guò)減壓蒸餾分離的乙酸香茅酯與標(biāo)樣進(jìn)行紅外光譜的鑒定。結(jié)果如圖 6所示??梢?jiàn),樣品的紅外光譜圖與美國(guó) Sigma-Fluka公司的色譜醇標(biāo)準(zhǔn)品基本一致??梢宰C明產(chǎn)物為乙酸香茅酯。

圖 6 乙酸香茅酯產(chǎn)品與標(biāo)準(zhǔn)樣品紅外圖譜分析注:1-標(biāo)準(zhǔn)樣品;2-產(chǎn)物乙酸香茅酯。

2.7.2 產(chǎn)物品質(zhì)鑒定 把產(chǎn)物乙酸香茅酯按照國(guó)標(biāo)GB 14156-93“食品添加劑—乙酸香茅酯”的內(nèi)容對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行分析結(jié)果見(jiàn)表 2。

表 2 產(chǎn)品品質(zhì)與乙酸香茅酯國(guó)標(biāo)的對(duì)比結(jié)果

從表 2中所示,產(chǎn)物乙酸香茅酯色澤好、氣味純正,且各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)地考察了華根霉全細(xì)胞脂肪酶(RCL)有機(jī)相催化合成乙酸香茅酯的過(guò)程,研究結(jié)果表明,在有機(jī)相中 RCL對(duì)合成乙酸香茅酯有較高的催化效率。由于乙酸較強(qiáng)的極性會(huì)抑制 RCL的催化效率,通過(guò)采用分步添加底物乙酸的方法,可以在較高的底物濃度下達(dá)到較好的催化效果,而且 RCL本身具有成本優(yōu)勢(shì),與其他商品化脂肪酶相比,在生物法合成乙酸香茅酯的工業(yè)生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

[1]Melo L,Pastore G M,Macedo GA.Optimized synthesis of citronellyl flavour esters using free and immobilized lipase from Rhizopus sp[J].ProcessBiochem,2005,40(10):3181-3185.

[2]Yadav GD,Lathi PS.Synthesisof citronellol laurate in organic media catalyzed by immobilized lipases:kinetic studies[J].Jmol CatalB:Enzym,2004,27(2-3):113-119.

[3]Lozano P,Piamtongkam R,Kohns K,et al.Ionic liquids improve citronellyl estersynthesis catalyzed by immobilized Candida antarcticalipase B in solvent-free media[J].Green Chemistry,2007,9(7):780-784.

[4]Garcia T,Sanchez N,MartinezM,et al.Enzymatic synthesis of fatty esters Part I.Kinetic approach[J].Enzyme Microb Technol,1999,25(7):584-590.

[5]Fonteyn F,Blecker C,Lognay G,et al.Optimization of lipase -catalyzed synthesis of citronellyl acetate in solvent-freemedium [J].BiotechnolLett,1994,16(7):693-696.

[6]Xu Y,Wang D,Mu X,et al.Biosynthesis of ethyl esters of short-chain fatty acids using whole-cell lipase fromRhizopus chinesisCCTCC M201021 in non-aqueous phase[J].Journal ofmolecular CatalysisB,Enzymatic,2002,18(1-3):29-37.

[7]謝紅想 .有機(jī)相中芳香酯合成用脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及其應(yīng)用[D].無(wú)錫:無(wú)錫輕工大學(xué)碩士論文,1998.

[8]Wang D,Xu Y,Teng Y.Synthetic activity enhancement of membrane-bound lipase fromRhizopus chinensisby pretreatment with isooctane[J].Bioprocess and Biosystems Engineering,2007, 30(3):147-155.

[9]孫志浩 .生物催化工藝學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社現(xiàn)代生物技術(shù)與醫(yī)藥科技出版中心,2005.

[10]Gandolfi R,Converti A,Pirozzi D,et al.Efficient and selective microbial esterification with dry mycelium ofRhizopus oryzae[J].J Biotechnol,2001,92(1):21-26.

[11]Gillies B YHaADW.Production of Flavor Esters by Immobilized Lipase J[J].BiotechnologyLetters,1987,9(10):709 -714.

Biosynthesis of citronellyl acetate using mycelium-bound lipase fromRhizopus chinesis

WANG Nan,WANG Dong,XU Yan*,ZHOU Y i-bo
(School ofBiotechnology,KeyLaboratory of IndustrialBiotechnology of theMinistry of Education,Southern Yangtze University,Wuxi 214122,China)

Seve ra l reac tion p a ram e te rs in the m yce lium-bound lip ase from Rhizop us chinens is(RCL)ca ta lyzes es te rifica tion we re inves tiga ted,high conve rs ion was ob ta ined by a lcohol/ac idm ola r rad io of1.2∶1a t40℃.But us ing highe r subs tra te concentra tions couldn’t achieve re la tive ly highe r conve rs ion.To imp rove the p roduc tion of the c itrone llyl ace ta te,an app roach by p ortion-w ise add ition of subs tra te was es tab lished.The conve rs ion of the p roduc t es te rwas inc reased to94%w ith highe r subs tra te leve l of0.2m ol/L.Comp a red w ith10comm e rc ia l l ip ases, RCL was p roved to be m os t suitab le for the synthes is of c itrone llyl ace ta te econom ica lly in non-aqueous p hase. The p roduc t of c itrone llyl ace ta te shows good color and p ure odor.

Rhizop us chinens is;m yce lium-bound lip ase;c itrone llyl ace ta te;non-aqueous p hase

TS202.3

B

1002-0306(2010)02-0307-04

乙酸香茅酯屬于萜烯短鏈脂肪酸酯類(lèi)化合物,天然存在于玫瑰油及香茅油中,具有清甜的檸檬果香及似玫瑰、薰衣草的香氣。由于香氣特征明顯受到廣大調(diào)香師的青睞,用于調(diào)配玫瑰、梔子、鈴蘭、香石竹、薰衣草和康乃馨等香型香精,是重要的香料成分并已廣泛應(yīng)用于飲食及化妝品等領(lǐng)域[1]。目前乙酸香茅酯的生產(chǎn)方式主要是化學(xué)合成的方法,還有極少量是從天然植物中分離提取。盡管化學(xué)合成的方法目前還比較經(jīng)濟(jì),但是人們對(duì)天然產(chǎn)物和高品質(zhì)產(chǎn)品興趣逐漸增強(qiáng),而從植物中提取又無(wú)法滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的需求,人們轉(zhuǎn)向用生物技術(shù)的方法生產(chǎn)。與化學(xué)法相比,酶促法催化合成的乙酸香茅酯被認(rèn)為是高質(zhì)量的天然產(chǎn)品,加上酶法反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)而吸引了許多人的研究,被看成是很有希望的工業(yè)化途徑[2]。目前人們對(duì)脂肪酶催化合成乙酸香茅酯的研究較少,在國(guó)外研究中主要使用一些商品化脂肪酶[3-5]。由于商品化脂肪酶的價(jià)格普遍較高,如果在工業(yè)生產(chǎn)中使用,生產(chǎn)成本將會(huì)大幅度提高。因此開(kāi)發(fā)具有較強(qiáng)催化能力且價(jià)格低廉的脂肪酶非常有吸引力。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)從酒曲中篩選得到的華根霉 Rhizopus chinensisCCTCC M201021在非水相中具有酯合成的能力[6-7],進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該菌株所產(chǎn)的脂肪酶為膜結(jié)合脂肪酶,可以進(jìn)一步穩(wěn)定酶的構(gòu)象[8]。通過(guò)凍干菌絲體可以直接投入使用,省去了提取、純化和固定化等工序從而節(jié)省了催化劑的生產(chǎn)成本。本研究以提高產(chǎn)物得率為目標(biāo),對(duì)華根霉菌絲結(jié)合脂肪酶非水相合成乙酸香茅酯的特性進(jìn)行研究。

2009-06-03 *通訊聯(lián)系人

王楠 (1985-),女,碩士研究生,研究方向:非水相酶促催化。

國(guó)家高科技發(fā)展計(jì)劃 (863)項(xiàng)目 (2007AA100401);江蘇省自然科學(xué)基金 (BK2007020);生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題。

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