李慧，王惠玲，吳雅琨，黃衛(wèi)東

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

天然葡萄酒酵母菌種的分離、鑒定和釀造性能評(píng)價(jià)*

李慧，王惠玲，吳雅琨，黃衛(wèi)東

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

從“北紅”葡萄汁的自然發(fā)酵液中分離天然葡萄酒酵母，利用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)分離菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定，共分離到7種類(lèi)型的葡萄酒酵母，其中1株具有典型的釀酒酵母特征。對(duì)該株酵母進(jìn)行進(jìn)一步的顯微形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及DNA序列分析，證明為釀酒酵母。利用模擬葡萄汁模擬標(biāo)準(zhǔn)葡萄汁的成分，以2株商業(yè)葡萄酒酵母為參照，研究分離釀酒酵母的釀造特性，研究結(jié)果顯示，分離菌株具有良好的酒精轉(zhuǎn)化性能，較快的酒精發(fā)酵速率及甘油產(chǎn)生能力。對(duì)模擬葡萄汁進(jìn)行改良以研究分離菌株的脅迫耐受性，研究結(jié)果表明，改良模擬葡萄汁適于葡萄酒酵母單一抗逆性能的研究，分離菌株具有良好的溫度(特別是高溫)、酒精、滲透壓和低pH耐受性。天然葡萄汁對(duì)分離菌株釀造性能的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證明該菌株良好的釀造特性。

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，模擬葡萄汁，改良模擬葡萄汁，天然葡萄酒釀酒酵母，釀造性能

葡萄酒的風(fēng)格不僅與葡萄品種和釀造工藝密切相關(guān)，酵母等微生物的發(fā)酵作用也非常顯著。因此，雖然有商業(yè)葡萄酒酵母可供使用，但一些葡萄酒生產(chǎn)商更傾向于選育葡萄產(chǎn)區(qū)酵母來(lái)生產(chǎn)具有產(chǎn)區(qū)特色的葡萄酒［1－2］。產(chǎn)區(qū)酵母已經(jīng)適應(yīng)了本地的微環(huán)境，易于在葡萄酒發(fā)酵中占主導(dǎo)地位，更重要的是，使用產(chǎn)區(qū)酵母釀造葡萄酒可以保證產(chǎn)區(qū)的典型特色［3］。

中國(guó)葡萄酒的工業(yè)化雖持續(xù)約100多年，但為保證發(fā)酵速率和發(fā)酵產(chǎn)品的一致性并避免污染，大多數(shù)國(guó)內(nèi)葡萄酒生產(chǎn)商都使用進(jìn)口活性干酵母。而我國(guó)葡萄栽培面積廣闊，葡萄適栽區(qū)的生態(tài)地理環(huán)境多種多樣，蘊(yùn)藏著豐富的葡萄釀酒微生物資源。這些微生物資源長(zhǎng)期被擱置，因此分離收集優(yōu)質(zhì)葡萄酒產(chǎn)區(qū)酵母，利用合理的葡萄酒酵母培養(yǎng)體系對(duì)酵母釀造性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)本土酵母菌種的選育和生產(chǎn)高品質(zhì)的“特色”、“產(chǎn)區(qū)”葡萄酒非常必要和迫切。

本研究從“北紅”葡萄汁的自然發(fā)酵液中分離出天然葡萄酒酵母，利用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)分離菌株進(jìn)行了分類(lèi)鑒定，并采用模擬葡萄汁及在此基礎(chǔ)上改良的模擬葡萄汁對(duì)分離菌株進(jìn)行釀造性能研究，克服了使用天然葡萄汁進(jìn)行酵母釀造性能研究的不足，探索了一套適于分離、鑒定及評(píng)價(jià)葡萄酒酵母的系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 葡萄原料及試驗(yàn)菌種

1.1.1 釀酒葡萄原料

中科院植物研究所(北京)葡萄園采摘成熟的紅葡萄酒釀造品種——“北紅”(Muscat hamburg×V.amurensis)葡萄果實(shí);河北懷來(lái)葡萄園采摘成熟的“赤霞珠”葡萄果實(shí)(Vitis vinifera L.cv.Cabernet Sauvignon)。

1.1.2 試驗(yàn)菌種

釀酒酵母BH8(Saccharomyces cerevisia)，本實(shí)驗(yàn)室分離并保存;商業(yè)葡萄酒酵母AWRI R2和Freddo，分別由Marivin(Australian)及 Erbsl?h(Germany) 公司商業(yè)化，因具有良好的發(fā)酵性能而被國(guó)內(nèi)的一些葡萄酒廠使用。為方便說(shuō)明，分別將酵母AWRI R2，F(xiàn)reddo和BH8重新編號(hào)為A、F和B。

1.2 葡萄汁

1.2.1 天然葡萄汁

“北紅”及“赤霞珠”葡萄經(jīng)除梗、破碎后添加0.03g/L的果膠酶和100 mg/L的SO2，混合均勻后備用。

1.2.2 模擬葡萄汁 (model synthetic medium，MSM)

MSM培養(yǎng)基可以模擬標(biāo)準(zhǔn)葡萄汁的成分，適于研究葡萄酒酵母的釀造特性［4－5］。模擬葡萄汁的成分為(g/L):葡萄糖 (100)，果糖 (100)，酒石酸(3)，檸檬酸 (0.3)，L－蘋(píng)果酸 (0.3)，KH2PO4(2)，MgSO4·7H2O(0.2)。氮源 (190 mg total N/L):(NH4)2SO4(0.3 g)，Asn(0.6 g)。無(wú)機(jī)鹽 (mg/L):MnSO4·H2O(4)，ZnSO4·7H2O(4)，CuSO4·5H2O (1)， KI(1)， CoCl2· 6H2O (0.4)，(NH4)6Mo7O24·4H2O(1)，H3BO3(1)。維生素(mg/L):肌醇 (300)，生物素 (0.04)，硫酸銨 (1)，吡哆醇(1)，煙酸 (1)，泛酸(1)。脂肪酸 (mg/L):棕櫚酸 (1)，棕櫚烯酸 (0.2)，硬脂酸 (3)，油酸(0.5)，亞油酸 (0.5)，亞麻酸 (0.2)。脂肪酸混合物用Tween 80及100%的乙醇溶解，pH值調(diào)整為3.3。

1.3 培養(yǎng)基

(1)YPD固體培養(yǎng)基(g/L):酵母粉(10)，蛋白胨(20)，葡萄糖(20)，瓊脂(20)。

(2)葡萄酒酵母WL鑒別培養(yǎng)基(g/L):酵母粉(4.0)，胰蛋白胨 (5.0)，葡 萄糖 (50)，KH2PO4(0.55)，KCl(0.425)，CaCl2(0.125)，MgSO4(0.125)，F(xiàn)eCl3(0.002 5)，MnSO4(0.002 5)，瓊脂(20)，溴甲酚綠(0.022)。

(3)改良模擬葡萄汁:改良模擬葡萄汁的成分與模擬葡萄汁的成分基本相同，但葡萄糖及果糖的濃度分別調(diào)整為10g/L，pH值調(diào)整為5.8。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 天然葡萄酒酵母的分離、純化與鑒定

1.4.1.1 葡萄酒自然發(fā)酵

將采集的用以分離酵母的葡萄樣品(“北紅”葡萄)除梗、破碎，添加果膠酶。取混勻后的400mL葡萄汁分裝入滅菌的500mL三角瓶中，25℃自然發(fā)酵。發(fā)酵工藝采用紅葡萄酒的發(fā)酵工藝，不添加商業(yè)酵母及SO2。期間取樣用于分離酵母，取樣重復(fù)2次。

1.4.1.2 天然葡萄酒酵母的分離與純化

葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中取樣，將樣品梯度稀釋后涂布于YPD平板以分離酵母，28℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，結(jié)合鏡檢和菌落的形態(tài)觀察，從平板上挑取分離良好、具有典型性的單菌落，經(jīng)進(jìn)一步純化后轉(zhuǎn)管低溫保存。

1.4.1.3 天然葡萄酒酵母的菌種鑒定

將分離純化的酵母菌種梯度稀釋后涂布于WL平板，25℃培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落顏色和形態(tài)。挑取具有典型釀酒酵母形態(tài)特征的菌株，送中科院微生物研究所進(jìn)行酵母生理和分子生物學(xué)鑒定。

1.4.2 葡萄酒釀造試驗(yàn)

所有的釀造試驗(yàn)使用紅葡萄酒的釀造工藝，試驗(yàn)進(jìn)行3次，使用滅菌的三角瓶，靜止培養(yǎng)，活化菌種接種量為0.5%，25℃培養(yǎng)。三角瓶體積/葡萄汁的體積為5/4，使用棉塞或添加有濃H2SO4的發(fā)酵栓封口。

1.4.3 葡萄酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)

酵母細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)行3次，使用滅菌的三角瓶搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)基為改良模擬葡萄汁，接種量為0.5%，三角瓶體積/培養(yǎng)基體積為5/1，培養(yǎng)條件為28℃、160 r/min。每2 h取樣1次，利用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌液的吸光度并結(jié)合酵母細(xì)胞活性分析以繪制酵母生長(zhǎng)曲線。

1.4.4 葡萄酒酵母脅迫耐受性能試驗(yàn)

1.4.4.1 溫度(高溫)耐受性能試驗(yàn)

活化菌種轉(zhuǎn)接于改良模擬葡萄汁中，接種量為1%。分別在22、28、37、40及44℃下三角瓶搖床培養(yǎng)24 h，每3 h取樣1次，利用分光光度計(jì)在600 nm測(cè)定菌液的吸光度以繪制酵母生長(zhǎng)曲線。

1.4.4.2 酒精耐受性能試驗(yàn)

活化菌種轉(zhuǎn)接于酒精濃度調(diào)整為4%、8%、10%和12%的改良模擬葡萄汁中，接種量為1%，28℃培養(yǎng)24 h，每3 h取樣1次，利用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌液的吸光度以繪制酵母生長(zhǎng)曲線，以不添加酒精的為對(duì)照。

1.4.4.3 滲透壓耐受性能試驗(yàn)

酵母滲透壓試驗(yàn)經(jīng)常使用NaCl和山梨醇作為滲透壓處理劑［6－7］。為避免離子傷害，本試驗(yàn)選用非離子的，不被酵母代謝利用的山梨醇作為滲透壓脅迫處理劑。1mol/L山梨醇添加到含20g/L糖的培養(yǎng)基中所引起的滲透壓相當(dāng)于200g/L糖引起的滲透壓［8－9］。

活化菌種轉(zhuǎn)接于含 1.0、1.5、1.7 及 2.0mol/L山梨醇的改良模擬葡萄汁，接種量為1%，28℃培養(yǎng)24 h，每3 h取樣1次，以不添加山梨醇的為對(duì)照，利用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌液的吸光度以繪制酵母生長(zhǎng)曲線。

1.4.4.4 pH 耐受性能試驗(yàn)

用5mol/L H2SO4或5mol/L NaOH將改良模擬葡萄汁的 pH 值調(diào)整為 2.8、3.0、3.3、5.8 及 8.0，活化好的菌種分別轉(zhuǎn)接于上述培養(yǎng)基中，接種量為1%，28℃培養(yǎng)24 h，每3 h取樣1次，測(cè)定600 nm下菌液的吸光度以繪制酵母生長(zhǎng)曲線。

以上所有試驗(yàn)，各處理重復(fù)次數(shù)均為3次。

1.5 分析方法

1.5.1 細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定

測(cè)定菌液的OD600nm值或菌液梯度稀釋后涂布于YPD平板，28℃培養(yǎng)72 h后計(jì)算活菌落數(shù)。

1.5.2 葡萄糖、果糖、乙醇、甘油的檢測(cè)及CO2失重的測(cè)定

1.5.2.1 葡萄糖、果糖、乙醇、甘油的檢測(cè)

按Liu等［10］的方法，使用高效液相色譜儀 (Waters 2695，Milford，MA，USA)，色譜柱為 Aminex HPX－87H(300 mm ×7.8 mm)(Bio－Rad;USA)。柱溫65℃;流動(dòng)相為0.005mol/L H2SO4，流速為0.600mL/min。檢測(cè)器為示差檢測(cè)器;進(jìn)樣量20μL。

1.5.2.2 CO2失重的測(cè)定

接種前、接種后及發(fā)酵過(guò)程中，用電子天平稱重(精確到0.01 g)發(fā)酵瓶，稱前先搖晃瓶子，以排除CO2。

1.5.4 總酸的測(cè)定

按國(guó)標(biāo)GB/T 15038－2006指示劑法進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有的試驗(yàn)進(jìn)行 3次，使用 SPSS11.0(SPSS Inc.Chicago，IL)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。S－N－K(NEWMAN Keuls)單因素方差分析比較平均值。差異顯著性設(shè)為 P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 天然葡萄酒酵母的分離

從“北紅”的自然發(fā)酵液中分離的酵母在WL培養(yǎng)基上可形成7種不同的菌落形態(tài)。參照Cavazza等［11］詳細(xì)描述的葡萄酒相關(guān)酵母在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落特征，其中BH8的菌落特征與釀酒酵母相符，在WL培養(yǎng)基上為奶油色帶綠色，球形突起，表面光滑，不透明。顯微形態(tài)觀察顯示，細(xì)胞形狀為圓形、橢圓形、出芽生殖，呈典型的酵母形態(tài)。該組酵母經(jīng)中科院微生物所進(jìn)一步進(jìn)行生理生化試驗(yàn)及核糖體ITS區(qū)的克隆和測(cè)序，也證明為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。

2.2 分離釀酒酵母菌株在模擬葡萄汁中的釀造性能

2.2.1 分離釀酒酵母菌株酒精轉(zhuǎn)化能力及酒精發(fā)酵速率

模擬葡萄汁中，酵母還原糖的消耗、乙醇的產(chǎn)量、酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)及CO2的失重如圖1所示。

圖1 菌株A、B和F在模擬葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中糖消耗、乙醇產(chǎn)生(a)及CO2失重、酵母生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)曲線(b)

從圖1可以看出，與2株參照商業(yè)葡萄酒酵母菌株A和F相比，分離菌株B顯示了良好的乙醇轉(zhuǎn)化能力、乙醇轉(zhuǎn)化速率和生長(zhǎng)特征。發(fā)酵到第2天，酵母開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞數(shù)增殖到2.0×108CFU/mL［圖1(b)］，此時(shí)，糖消耗速率和乙醇生成速率加快［圖1(a)］，CO2失重值最大［圖1(b)］。發(fā)酵至第6天時(shí)，培養(yǎng)基中的糖降至0.5%以下，乙醇含量達(dá)到11%以上，發(fā)酵至第7天時(shí)，發(fā)酵基本結(jié)束，最終產(chǎn)生的乙醇濃度為11.01%(A)，11.02%(B)及11.03%(F)。

2.2.2 分離釀酒酵母菌株產(chǎn)甘油的能力

在模擬葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中，分離菌株B與2株商業(yè)菌株A和F甘油的產(chǎn)量如圖2所示。

圖2 菌株A、B和F在模擬葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中甘油的產(chǎn)生

從圖2可以看出，甘油的產(chǎn)量在發(fā)酵前2天增加迅速，隨后逐漸增加，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中甘油的含量分別達(dá)到5.28g/L(A)，5.51g/L(B)和5.17g/L(F)，與2株商業(yè)酵母菌株相比，菌株B顯示了良好的甘油生產(chǎn)能力。甘油不僅是酵母重要的抗逆應(yīng)答代謝產(chǎn)物，而且是一種重要的風(fēng)味化合物，葡萄酒中的甘油具有甜味，可增加葡萄酒的圓潤(rùn)感和豐厚感［12］。酵母產(chǎn)甘油的能力也是葡萄酒酵母菌種選育的重要指標(biāo)。

2.3 改良模擬葡萄汁對(duì)葡萄酒釀酒酵母抗逆性能的測(cè)定

葡萄酒釀造過(guò)程中，要求具有耐溫度變化、耐高滲透壓、耐酒精、耐低pH等抗逆性能［13］，它是葡萄酒酵母菌種選育的重要指標(biāo)。

2.3.1 改良模擬葡萄汁對(duì)葡萄酒釀酒酵母生長(zhǎng)的影響

使用MSM研究葡萄酒酵母的釀造性能，具有使用方便、結(jié)果重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。但是，作為可被酵母代謝利用的碳源，MSM中的糖濃度(200g/L)將不斷減少，同時(shí)培養(yǎng)基中的乙醇濃度將不斷增加，加上培養(yǎng)基中較低的pH值(pH 3.3)等各種因素的影響，用該培養(yǎng)基研究酵母的抗逆性能，通常是多種脅迫因素對(duì)酵母的影響。參照培養(yǎng)酵母常用的YPD培養(yǎng)基，本研究將MSM中還原糖的含量調(diào)整為20g/L，pH值調(diào)整為5.8。首先檢測(cè)改良模擬葡萄汁對(duì)葡萄酒酵母生長(zhǎng)的影響(圖3)。

圖3 菌株A、B和F在YPD培養(yǎng)基(a)和改良模擬葡萄汁(b)中的生長(zhǎng)情況

從圖3可以看出，在相同接種量、相同培養(yǎng)條件下，分離菌株B和商業(yè)菌株A、菌株F在改良模擬葡萄汁中都能生長(zhǎng)良好。與在YPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)相比，雖然3株酵母的遲滯期大約延長(zhǎng)了1 h，但對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期都比較長(zhǎng)，并沒(méi)有受到顯著影響;用改良模擬葡萄汁培養(yǎng)3株酵母至穩(wěn)定期時(shí)，酵母細(xì)胞數(shù)也都分別達(dá)到2.0×108CFU/mL以上。因此，改良模擬葡萄汁也適合葡萄酒酵母的生長(zhǎng)，可用于培養(yǎng)葡萄酒酵母。

2.3.2 分離酵母菌株的溫度(高溫)耐受性分析

不同培養(yǎng)溫度(22、28、37、40 及 44℃)下，分離酵母菌株B及菌株A、菌株F在改良模擬葡萄汁中的生長(zhǎng)曲線如圖4所示。

圖4 不同培養(yǎng)溫度下，菌株A、B和F在改良模擬葡萄汁中的生長(zhǎng) (n=3，sd＜16%)

從圖4可以看出，分離菌株B與菌株A、菌株F一樣可以在較寬的溫度(高溫)范圍內(nèi)生長(zhǎng)。28℃是酵母的適宜生長(zhǎng)溫度，22℃或37℃對(duì)該酵母生長(zhǎng)的影響比較小，只有當(dāng)培養(yǎng)溫度升高至40℃時(shí)，細(xì)胞的對(duì)數(shù)期才明顯延長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞的生物量?jī)H為28℃培養(yǎng)溫度下的30%(OD600的比值)左右。而在44℃的培養(yǎng)溫度條件下，酵母的生長(zhǎng)停滯，細(xì)胞長(zhǎng)久的處于遲滯期。

2.3.3 分離酵母菌株的乙醇耐受性分析

培養(yǎng)基中添加了4%、8%、10%及12%的乙醇后，酵母的生長(zhǎng)曲線如圖5所示。

從圖5可以看出，3株酵母都可以在含4%～10%乙醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，表現(xiàn)出良好的乙醇耐受性。但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞的生物量明顯降低。當(dāng)培養(yǎng)基中乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%和10%時(shí)，細(xì)胞的對(duì)數(shù)期明顯延長(zhǎng)，且10%的乙醇影響更為明顯，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞的生物量?jī)H為對(duì)照的30%(OD600的比值)左右。在含12%乙醇的培養(yǎng)基中，3株酵母的生長(zhǎng)都基本停滯。

圖5 菌株A、B和F在含不同濃度乙醇的改良模擬葡萄汁中的生長(zhǎng) (n=3，sd＜16%)

2.3.4 分離酵母菌株的滲透壓耐受性分析

從酵母在含不同濃度山梨醇的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(圖6)可以看出，與商業(yè)酵母菌株A和F對(duì)比，菌株B也表現(xiàn)出較好的滲透壓耐受性。雖然1.5mol/L的山梨醇已經(jīng)明顯抑制了酵母的生長(zhǎng)，但即使繼續(xù)增加山梨醇的濃度至2.0mol/L，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞的生物量仍能達(dá)到對(duì)照的50%(OD600的比值)左右。

圖6 菌株A、B和F在含不同濃度山梨醇的改良模擬葡萄汁中的生長(zhǎng) (n=3，sd＜16%)

2.3.5 分離酵母菌株的低pH值耐受性分析

不同pH值對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響如圖7所示。從圖7可以看出，與菌株F和菌株B相比，商業(yè)菌株A顯示了更寬的pH耐受范圍，但實(shí)驗(yàn)室新分離的菌株B和商業(yè)菌株F也能在較低的pH培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。pH值調(diào)整為3.3時(shí)對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響比較小，當(dāng)培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為3.0時(shí)，細(xì)胞的遲滯期和對(duì)數(shù)期都有所延長(zhǎng)，當(dāng)pH值為2.8時(shí)，3株酵母都停滯生長(zhǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)久的處于遲滯期。

圖7 菌株A、B和F在不同pH值的改良模擬葡萄汁中的生長(zhǎng) (n=3，sd＜16%)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，改良模擬葡萄汁可用于葡萄酒酵母單一脅迫耐受性能的研究。分離菌種具有良好的溫度(高溫)、酒精、滲透壓及低pH值耐受性能。

2.4 分離菌株在“北紅”葡萄汁及“赤霞珠”葡萄汁中發(fā)酵性能的比較

進(jìn)一步研究分離菌株在天然葡萄汁中的乙醇轉(zhuǎn)化性能。所使用的釀造原料為分離該菌株的“北紅”葡萄，及采自河北懷來(lái)葡萄園的“赤霞珠”葡萄。

2.4.1 葡萄汁基本成分分析

“北紅”葡萄汁及“赤霞珠”葡萄汁中糖、酸含量及pH值如表1所示。

表1 “北紅”葡萄汁及“赤霞珠”葡萄汁成分分析 (n=3，sd＜12%)

2.4.2 分離菌株在“北紅”葡萄汁及“赤霞珠”葡萄汁中的乙醇轉(zhuǎn)化能力

還原糖的消耗，乙醇的產(chǎn)量如圖8所示。

圖8 菌株A、B和F在“北紅”葡萄汁 (a)和“赤霞珠”(b)葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中糖的消耗及乙醇的產(chǎn)生

從圖8可以看出，分離菌株B及菌株A和F在天然葡萄汁中都表現(xiàn)出了良好的乙醇轉(zhuǎn)化能力和較快的乙醇轉(zhuǎn)化速率。在葡萄汁中的發(fā)酵周期僅為4 d。發(fā)酵結(jié)束時(shí)產(chǎn)生乙醇的濃度，“北紅”葡萄汁為11.63%(A)，11.72%(B)及 11.58%(F);“赤霞珠”葡萄汁為 12.03%(A)，11.84%(B)及 11.82%(F)。

2.4.3 分離菌株在“北紅”葡萄汁及“赤霞珠”葡萄汁中的甘油生成能力

“北紅”葡萄汁及“赤霞珠”葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中，分離菌株及2株商業(yè)菌株甘油的產(chǎn)量如圖9所示。

圖9 菌株A、B和F在“北紅”葡萄汁 (a)和“赤霞珠”(b)葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中甘油的產(chǎn)生

從圖9可以看出，3株酵母在2種葡萄汁中發(fā)酵，都能產(chǎn)生大量的甘油，含量高于6g/L。分離菌株顯示了更好的甘油生成能力，尤其使用“北紅”葡萄汁發(fā)酵，產(chǎn)生更多的甘油。

3 討論

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂被設(shè)計(jì)用于飲料發(fā)酵過(guò)程中微生物類(lèi)群的監(jiān)測(cè)。Cavazza 等［11］和 Pallmann 等［14］的研究表明，在葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)大多數(shù)典型的酵母菌種都可以用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行區(qū)分，主要基于菌落顏色和菌落形態(tài)。雖然該方法對(duì)于酵母菌種鑒定的準(zhǔn)確度無(wú)法與測(cè)序相比，但對(duì)于不需要非常準(zhǔn)確的分類(lèi)試驗(yàn)和數(shù)量較大的菌種鑒定工作來(lái)說(shuō)，WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂是相當(dāng)簡(jiǎn)便、快速并且也是十分有效和節(jié)儉的方法。本研究利用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)從“北紅”葡萄汁的自然發(fā)酵液中分離的天然葡萄酒酵母進(jìn)行分類(lèi)鑒定，共分離到7種類(lèi)型的葡萄酒酵母，其中一株具有典型的釀酒酵母特征。進(jìn)一步通過(guò)顯微形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及DNA序列分析也證明該酵母為釀酒酵母。

由于天然葡萄汁的供應(yīng)具有季節(jié)性限制，葡萄栽培產(chǎn)區(qū)、葡萄栽培品種等原因引起的葡萄汁成分的差異，使對(duì)選育葡萄酒酵母菌種釀造性能的評(píng)價(jià)難以長(zhǎng)期、有效、一致的進(jìn)行。因此，國(guó)外的研究人員［4－5］使用模擬葡萄汁(MSM)。MSM既可以模擬標(biāo)準(zhǔn)葡萄汁的成分，減少天然葡萄汁中的固態(tài)成分對(duì)分離酵母細(xì)胞的影響，還具有使用方便、結(jié)果重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。更重要的是MSM是完全化學(xué)合成的培養(yǎng)基，可以方便的進(jìn)行成分調(diào)整。但是，MSM不適于研究葡萄酒酵母的單一脅迫耐受性能，所以本研究將MSM進(jìn)行改良。改良后的MSM適于葡萄酒酵母的生長(zhǎng)并適于研究葡萄酒酵母的單一脅迫耐受性。采用模擬葡萄汁、改良模擬葡萄汁對(duì)實(shí)驗(yàn)室新分離葡萄酒釀酒酵母的釀造特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，分離菌種顯示了良好的乙醇轉(zhuǎn)化性能;較快的乙醇發(fā)酵速率及甘油產(chǎn)生能力;較好的溫度(特別是高溫)、乙醇、滲透壓及低pH值耐受性能。天然葡萄汁對(duì)該菌株釀造性能的研究進(jìn)一步支持上述結(jié)論。

本研究首先分離天然葡萄酒酵母，并對(duì)葡萄酒酵母菌種簡(jiǎn)便、快速的分離和鑒定方法進(jìn)行探索，進(jìn)一步利用葡萄酒酵母的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)體系研究分離菌株的釀造特性，為研究本土葡萄釀酒微生物資源的生物多樣性，分離收集優(yōu)質(zhì)葡萄酒產(chǎn)區(qū)酵母菌株，推動(dòng)產(chǎn)區(qū)葡萄酒的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

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Study on the Isolation，Identification of Native Wine Yeast and the Evaluation of Its Oenological Characteristics

Li Hui，Wang Hui－ling，Wu Ya－kun，Huang Wei－dong
(College of Food Science ＆ Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Native wine yeasts isolated from spontaneously fermenting Beihong red wine grape(Muscat Hamburg×V.amurensis)were plated onto Wallerstein Laboratory Nutrient Agar(WL).Seven unique colony morphologies were identified and one strain showed distinct character of Saccharomyces cerevisia.Further identification by micro－morphological observation，physiological and biochemical experiment and DNA sequence analysis also confirmed the strain as S.cerevisia.The model synthetic medium which could simulate a standard grape juice was used to study the important enological traits of the newly selected S.cerevisia，the results showed that the newly selected S.cerevisia had high ethanol production，high fermentation activity and high glycerol production.The model synthetic medium was modified to study the stress tolerance of the newly selected S.cerevisia，the result showed that the modified model synthetic medium could be used for analyzing single stress tolerance of wine yeast，the newly selected wine yeast could tolerant high temperature，high ethanol concentration，high sorbitol concentration and low pH.Pilot scale fermentation using nature grape juice also showed that the newly selected S.cerevisia had desirable fermentative behavior.

WL medium，model synthetic medium，modified model synthetic medium，native wine yeast，oenological characteristics

博士研究生(黃衛(wèi)東教授為通訊作者)。

*北京科委重大項(xiàng)目(D07060500160701)

2010－04－21，改回日期:2010－09－07