盧仁泉,胡 娟,吳興中,郭 林＊

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科、復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系,上海200032;2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系)

近年來(lái)針對(duì)卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物方面的研究很多,至今CA125仍然臨床上應(yīng)用最廣泛的卵巢癌血清標(biāo)志物。但由于CA125的靈敏度僅為40%左右,而且在某些良性疾病中也會(huì)升高,大大限制它的臨床應(yīng)用。2003年,Hellstrom研究發(fā)現(xiàn),人附睪上皮分泌蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)可應(yīng)用于卵巢癌的早期診斷,其敏感度與特異性均優(yōu)于CA125[1,2]。我們進(jìn)行了HE4的克隆表達(dá),希望能為進(jìn)一步制備HE4診斷試劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和菌株 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株由上海市腫瘤研究所惠贈(zèng)。pUCm-T載體購(gòu)自申能博彩公司,PET28a(+)表達(dá)載體由浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所惠贈(zèng)。TOP10、BL21菌株由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑及工具酶 Trizol試劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自 Introvigen公司。dNTP、10×PCR buffer、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和 SalⅠ均為Takara生物公司產(chǎn)品。凝膠回收試劑盒由Genebase公司提供。質(zhì)粒抽提試劑、抗His-Tag抗體購(gòu)自天根生物公司。引物合成與測(cè)序由上海生工公司完成,引物序列為 P1:5′-accgggatccatgcctgcttgtcgcctagg-3′和P2:5′-acgcgtcgactcagaaattgggagtgacac-3′。其他主要試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及 RNA提取 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株用10%小牛血清在5%CO2、37℃條件下常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞數(shù)量到達(dá)5×106時(shí),用 Trizol試劑按操作說(shuō)明書抽提總RNA。

1.4 RT-PCR擴(kuò)增 HE4基因 利用25μlRT體系,即 RNA 2μl、OligdT 1μl、H2O 8.5μl,5 ×RT buffer 5 μl、2.5 mMdNTP 8μl,M-MLV 0.5μl;42℃30 min,99℃5 min,5℃5 min,得到 RT產(chǎn)物(cDNA)。50μl PCR體系:RT產(chǎn)物1μl,H2O 36μl,10×buffer 5μl,2.5mMdNTP 5μl,引物 P1、P2各 1μl,Taq聚合酶 1 μl。PCR反應(yīng)條件為:94℃5 min;94℃30 s,60℃30 s,72℃45 s,35個(gè)循環(huán);72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖(Gibco公司)凝膠電泳分離與鑒定,并用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.5 HE4基因重組測(cè)序質(zhì)粒的構(gòu)建 將4μl PCR產(chǎn)物與1μl PUCm-T載體在T4連接酶的作用下,16℃循環(huán)水浴連接4-5小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)TOP10細(xì)菌中,涂布于含氨芐青霉素(100 mg/L)LB平板上,用 IPTG作為誘導(dǎo)劑,X-Gal作為生色劑,37℃16-24小時(shí),形成藍(lán)白斑。挑取白色菌落,接種含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液,培養(yǎng)過(guò)夜。取部分菌液測(cè)序,并用質(zhì)粒抽提試劑提取菌液中的重組質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.6 HE4基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 利用PET28a質(zhì)粒為載體構(gòu)建原核表達(dá)載體,根據(jù)PET28a質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn),用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ,SalⅠ分別雙酶切PUCm-T-HE4和PET28a,凝膠回收得到HE4片段和酶切后的PET28a質(zhì)粒,兩者同上(重組測(cè)序質(zhì)粒構(gòu)建的連接部分)連接后得到原核表達(dá)載體PET28a-HE4。將該P(yáng)ET28a-HE4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)表達(dá)菌E.coliBL21中,涂布于含卡那霉素(100 mg/L)的LB平板,37℃培養(yǎng)16-24小時(shí),挑取菌落,轉(zhuǎn)種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定。

1.7 HE4融合蛋白的表達(dá)及鑒定 從鑒定正確的上述LB培養(yǎng)液中取少量菌液,轉(zhuǎn)種后待細(xì)菌生長(zhǎng)至A600為0.6左右時(shí),加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。我們進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化:在37℃和28℃兩個(gè)溫度條件下,分別加入IPTG使其終濃度為0.1,0.2,0.5和1.0 mmol/L進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),選擇最佳誘導(dǎo)條件。在最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)后1,2,3,4和5 h經(jīng)SDS-PAGE鑒定HE4融合蛋白的表達(dá)量,確定最佳表達(dá)時(shí)間。然后收集細(xì)菌沉淀,用 PBS重懸后,經(jīng)超聲后取上清進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,以及利用抗His-Tag抗體進(jìn)行Western blot鑒定。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增 HE4基因 用 Trizol試劑抽提出總 RNA,再以 RNA為模板,特異性擴(kuò)增 HE4基因,得到大小約為400 bp的DNA片斷。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,見(jiàn)圖1。

圖1 HE4基因 RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 重組測(cè)序質(zhì)?？寺?、測(cè)序

HE4基因的擴(kuò)增產(chǎn)物與PUCm-T載體連接后轉(zhuǎn)化入TOP10菌,LB平板上生長(zhǎng)出白色光滑菌落。白色菌落LB液培養(yǎng)后,抽提其中質(zhì)粒,經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切結(jié)果,如圖2所示(400 bp左右處出現(xiàn)目的條帶)。測(cè)序結(jié)果也顯示重組質(zhì)粒含有HE4基因。

2.3 HE4基因表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建的PET28a-HE4重組表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ雙酶切后,可產(chǎn)生400 bp左右的DNA片段(HE4基因片段),鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3。測(cè)序的結(jié)果也表明已連接且連接順序也正確。

2.4 HE4基因表達(dá)及鑒定

上述的重組表達(dá)質(zhì)粒PET28a-HE4轉(zhuǎn)化入BL21表達(dá)菌后經(jīng) IPTG誘導(dǎo),表達(dá)出了 HE4融合蛋白。最佳誘導(dǎo)條件確定為在28℃條件加入的IPTG終濃度應(yīng)為0.5mmol/L,最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5 h。誘導(dǎo)表達(dá)的HE4融合蛋白 SDS-PAGE和western blot鑒定結(jié)果 ,見(jiàn)圖4。

3 討論

Kirchhoff等[3]最先在人的附睪上皮中克隆出HE4基因,其編碼精子成熟有關(guān)的蛋白酶抑制劑。該基因位于染色體20q12-13.1,全長(zhǎng)為12 kb左右,由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成,存在多種剪切方式,編碼分泌小分子蛋白,均含有高度保守的WAP(Whey Acidic Protein)結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域含有8個(gè)半胱氨酸組成的4個(gè)二硫鍵核心區(qū)域,與細(xì)胞外蛋白酶抑制劑有很高的同源性[4]。1999年,Schummer[5]等運(yùn)用cDNA array雜交技術(shù)分析了不同來(lái)源的卵巢癌及癌旁組織中的基因表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)HE4 mRNA在卵巢癌組織中高表達(dá),但在癌旁組織中不表達(dá)。直至2003年,Hellstrom等[1]研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)卵巢癌患者血清中的HE4蛋白量比正常人有明顯提高,證實(shí)該蛋白可作為臨床診斷卵巢癌的一個(gè)新指標(biāo)。

圖2 重組質(zhì)粒pUCm-T-HE4雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒PET28a-HE4雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖4 HE4融合蛋白表達(dá)的SDS-PAG電泳及western blot鑒定結(jié)果

也有學(xué)者認(rèn)為HE4可以與CA125聯(lián)合檢測(cè)來(lái)提高卵巢癌的診斷敏感性[6,7]。Moore等[7]在對(duì)幾種新型卵巢癌腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn),單個(gè)腫瘤標(biāo)志物測(cè)定時(shí),HE4的敏感度最高,可達(dá)72.9%,對(duì)于早期腫瘤(臨床分期 I期),HE4是最好的單個(gè)標(biāo)志物。而聯(lián)合檢測(cè)時(shí),CA125、HE4聯(lián)合測(cè)定敏感性最高。

但是,目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)檢測(cè)HE4的注冊(cè)試劑盒供應(yīng),該項(xiàng)檢測(cè)在臨床上的研究也還未廣泛展開(kāi)。為使該指標(biāo)應(yīng)用于臨床,得以早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌,利用基因工程手段獲得HE4融合蛋白作為抗原,并從而研制出HE4檢測(cè)試劑盒,顯得尤為重要。

本研究工作采用RT-PCR技術(shù)從SKOV3細(xì)胞株總RNA中擴(kuò)增到一條400 bp左右大小的DNA片斷,經(jīng)克隆后測(cè)序鑒定,證實(shí)此片斷為 HE4基因的序列。我們進(jìn)一步將該 HE4基因與克隆載體PUCm-T進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的TOP10菌中,含重組質(zhì)粒PUCm-T-HE4的TOP10菌生長(zhǎng)出白色光滑菌落。挑選白色菌落轉(zhuǎn)種后,抽提出大量克隆的重組質(zhì)粒,進(jìn)行電泳鑒定以及克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明HE4基因已成功克隆。再將該重組測(cè)序質(zhì)粒和表達(dá)載體PET28a(+)均進(jìn)行雙酶切后連接,轉(zhuǎn)化入BL21表達(dá)菌中誘導(dǎo)表達(dá),后經(jīng)SDS-PAGE及western blot鑒定,結(jié)果表明可表達(dá)HE4融合蛋白且為可溶性高表達(dá)。確定的最佳誘導(dǎo)溫度為28℃,最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5h左右,表達(dá)出的HE4融合蛋白,分子量在14 KD左右,而且該融合蛋白帶有 His標(biāo)簽,大大方便了其進(jìn)一步純化。

本研究獲得的HE4蛋白可用作抗原或者診斷試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品,為開(kāi)發(fā)檢測(cè)卵巢癌的診斷試劑提供了原料保證。我們將進(jìn)一步純化、免疫動(dòng)物獲得抗體,為卵巢癌的診斷開(kāi)辟新手段奠定基礎(chǔ)。

[1]Hellstrom I,Raycraft J,Hayden2Ledbetter M,et al.The HE4(WFDC2)protein is a biomarker for ovarian carcinoma[J].Cancer Res,2003,63(13):3695.

[2]Drapkin R,Von Horsten HH,Lin YF,et al.Human epididymis protein 4(HE4)is a secreted glycoprotein that isoverexpressed by serousand endometrioid ovarian carcinomas[J].Cancer Res,2005,65(6):2162.

[3]Kirchhoff C,Habben I,Ivell R,et al.A major human epididymis-specific cDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitors[J].Biol Reprod 1991,45:350.

[4]Clauss A,Lilja H,Lundwall A.A locuson human chromosome 20 contains several genesexpressing protease inhibitor domainswith homology to whey acidic protein[J].Biochem J,2002,368:233.

[5]SchummerM,Wallap VN,Bumgarner RE,et al.Comparative hybridization of an array of 21500 ovarian cDNAs for the discovery of genes overexpressed in ovarian carcinomas[J].Gene,1999,238(1):375.

[6]Rosen DG,Wang L,Atkinson JN,etal.Potentialmarkers that complement expression of CA125 in epithelial ovarian cancer[J].Gynecol Oncol 2005,99(2):267.

[7]Moore RG,Brown AK,Miller MC,et al,The use ofmultiple novel tumor biomarkers for the detection of ovarian carcinoma in patientswith a pelvic mass[J].Gynecol Oncol,2008,108(2):402.