曹 昭,萬(wàn) 敏,孫陸果,胡小平,于永利,王麗穎,張培因*

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院1.分子生物學(xué)教研室;2.免疫學(xué)教研室,吉林 長(zhǎng)春 130021)

兩種尿素濃度測(cè)定方法的比較

曹 昭1,萬(wàn) 敏1,孫陸果1,胡小平1,于永利2,王麗穎1,張培因1*

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院1.分子生物學(xué)教研室;2.免疫學(xué)教研室,吉林 長(zhǎng)春 130021)

*通訊作者

血清尿素作為臨床檢測(cè)腎小球?yàn)V過(guò)功能的一項(xiàng)指標(biāo)被廣泛應(yīng)用,目前主要測(cè)定方法有尿素酶速率法、尿素酶電極法[1]、二乙酰一肟法[2]和流動(dòng)注射分析法[3]等,其中二乙酰一肟法應(yīng)用最為廣泛,但具有線性范圍窄、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、易褪色和影響因素多等的缺點(diǎn)。為了克服這些不足,建立了一種快捷、方便的尿素檢測(cè)方法-對(duì)對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色法[4],其原理是對(duì)二甲基氨基苯甲醛可以與尿素反應(yīng)生成帶檸檬黃綠色的物質(zhì),顏色的與一定濃度范圍的尿素呈線性相關(guān)。此外,該反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度25℃,顯色時(shí)間5 min就達(dá)到穩(wěn)定,即可進(jìn)行比色測(cè)定。通過(guò)對(duì)兩種不同方法的測(cè)定結(jié)果比較,探討對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色法代替二乙酰一肟法,作為尿素含量測(cè)定方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 722型分光光度計(jì)。100 mmol/L尿素標(biāo)準(zhǔn)液;179.9 mmol/L二乙酰一肟溶液;顯色劑:二甲基氨基苯甲醛0.2 g,溶于9 ml無(wú)水乙醇后,加入1 ml濃鹽酸。酸性試劑:離子水約 100 ml,然后加入濃硫酸44 ml、85%磷酸66 ml。冷至室溫后,加入氨基硫脲50 mg及硫酸鎘2 g,溶解后稀釋至1 L。

1.2 方法

二乙酰一肟法 取尿素標(biāo)準(zhǔn)液在0-25 mmol/L范圍內(nèi),從高到底稀釋為5個(gè)濃度后,分別取0.01 ml加入各試管中后,加入5 ml酸性試劑和0.5ml二乙酰一肟溶液,混勻,置沸水浴加熱12 min,取出置冷水中冷卻5 min,以超純水調(diào)零,測(cè)定A540吸收測(cè)定值,做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品的尿素濃度。

對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色法 取尿素標(biāo)準(zhǔn)液在0～70 mmol/L范圍內(nèi),從高到底稀釋為稀釋為7個(gè)濃度,分別取0.5 ml加入各試管中后,加入5.25 ml超純水和0.5 ml顯色液。以超純水調(diào)零,測(cè)定A420吸收值,做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品的尿素濃度。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程

取濃度為100 mmol/L的尿素標(biāo)準(zhǔn)液,用超純水稀釋成各種不同濃度的樣品,用兩種方法分別按濃度從低到高、在從高到低的順序測(cè)定兩次后取平均值,將理論值(Y)與測(cè)定值(X)作線性回歸分析,二乙酰一肟法和對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色法分別在尿素溶液濃度為1 mmol/L-25 mmol/L和1 mmol/L-70 mmol/L范圍內(nèi)符合郎伯-比爾定律,其回歸曲線見(jiàn)圖1,線性方程見(jiàn)表1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

表1 兩種方法的線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 精密度對(duì)比試驗(yàn)

取3個(gè)不同濃度的尿素溶液,分別用二乙酰一肟法和對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色法重復(fù)測(cè)定7次后,取平均值進(jìn)行計(jì)算,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.00-2.12、0.98-2.80,兩種方法對(duì)同一樣品的測(cè)定結(jié)果,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P＞0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表2。

表2 兩種測(cè)定方法的精密度對(duì)比(n=7)

2.3 回收率對(duì)比試驗(yàn)

取3個(gè)不同濃度的尿素溶液,分別加入5 mmol/L尿素標(biāo)準(zhǔn)液,用二乙酰一肟法和對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色法重復(fù)測(cè)定7次后,取平均值進(jìn)行計(jì)算,其回歸率分別為 98.3%-102.4%和 99.2%-102.3%,見(jiàn)表3。

表3 兩種測(cè)定方法的回收率對(duì)比(n=7)

3 討論

本研究結(jié)果顯示,二乙酰一肟法和對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色法測(cè)對(duì)同一尿素樣品連續(xù)測(cè)定,其回收率分別為98.3%-102.4%和99.2%-102.3%,結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色法的測(cè)定范圍大于二乙酰一肟法。二乙酰一肟法是應(yīng)用最為廣泛,需要設(shè)備簡(jiǎn)單,容易實(shí)現(xiàn),但需要加熱及冷卻,尤其是在標(biāo)本數(shù)量多時(shí),加熱開(kāi)始難以達(dá)到100℃,各管間受熱溫度也可能不一致,而且具有線性范圍窄、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、易褪色等缺點(diǎn)(每小時(shí)小于5%)。為了克服這些缺點(diǎn),研究者們[5-8]進(jìn)行了諸多的改進(jìn),以提高其線性范圍、減少褪色,但均不能徹底解決。本室建立對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色法,與二乙酰一肟法比較,該方法檢試劑單一、操作簡(jiǎn)單、顯色時(shí)間短且穩(wěn)定、線性范圍大、準(zhǔn)確度高、精密度好,方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,不需要特殊設(shè)備,能滿足檢測(cè)工作的要求,適應(yīng)于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室及相關(guān)部門的常規(guī)檢測(cè)。

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1007-4287(2010)01-0135-02

曹昭(1979-),男,博士,從事重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化及功能研究。

2009-01-26)