喬 俊 陳 威 張承東

(南開大學環(huán)境科學與工程學院,天津市城市生態(tài)環(huán)境修復與污染防治重點實驗室,教育部環(huán)境污染過程與基準重點實驗室,天津,300071)

添加不同營養(yǎng)助劑對石油污染土壤生物修復的影響＊

喬 俊 陳 威 張承東＊＊

(南開大學環(huán)境科學與工程學院,天津市城市生態(tài)環(huán)境修復與污染防治重點實驗室,教育部環(huán)境污染過程與基準重點實驗室,天津,300071)

實驗室條件下研究NPK復合肥、諾沃肥和腐殖酸三種物質(zhì)不同配比添加對石油污染土壤的生物修復效果.在 60d的修復實驗中,定期取樣測定土壤含油量、總異養(yǎng)菌數(shù)、石油烴降解菌數(shù)和脫氫酶活性,并采用 PCR-DGGE技術(shù)研究修復過程中微生物多樣性變化.結(jié)果表明,NPK肥的添加和 NPK肥-諾沃肥-腐殖酸復合添加能夠提高土壤中微生物的數(shù)量、微生物多樣性和脫氫酶活性.在含油量為 84600 mg·kg-1的土壤中,添加營養(yǎng)助劑的處理 60d后石油烴降解率為 31.3%—39.5%,不添加營養(yǎng)助劑的石油烴降解率僅為 3.5%.NPK肥-諾沃肥-腐殖酸復合添加對石油烴的降解率要高于NPK肥的單獨添加 (高 8%),其原因可能是諾沃肥-腐殖酸能夠有效提高土著微生物的活性,增加微生物的多樣性,增強石油烴的降解.

石油,生物修復,生物刺激,微生物活性,PCR-DGGE.

石油在勘探、開采、運輸以及儲存過程中不可避免地污染土壤生態(tài)系統(tǒng),進入土壤的石油可通過徑流、滲透、侵蝕等作用進一步污染地表水和地下水,并可通過食物鏈影響人類的健康.生物修復利用土壤中的微生物將有毒的有機物分解或降解成為低毒或無毒物質(zhì).生物刺激 (Biostimulation)是生物修復重要的策略之一.它通過提供微生物生長所需要的氮磷等營養(yǎng)元素,或改善微生物生長的環(huán)境條件,來刺激土著微生物的生長加速石油烴降解[1,2].

許多研究表明,諸如堆肥產(chǎn)物、市政污泥、牛糞、殼質(zhì)素、農(nóng)作物/植物莖桿、鋸屑、發(fā)酵殘渣和腐殖酸等多種營養(yǎng)物質(zhì),都是刺激土著微生物生長的營養(yǎng)助劑[3—6].這些營養(yǎng)助劑作用原理有提供碳氮源等營養(yǎng)物質(zhì);引入外來菌群,豐富土壤環(huán)境中的微生物數(shù)量;誘導降解性酶的產(chǎn)生;或起到類表面活性劑作用等.而且這些物質(zhì)都是廉價的,有些甚至是廢棄物,將這些物質(zhì)用于土壤修復既可達到修復目的,還有效降低了修復成本.

本文旨在構(gòu)建用于石油污染土壤修復的廉價高效復合營養(yǎng)助劑.選擇腐殖酸、諾沃肥和氮磷鉀復合肥三種物質(zhì),在實驗室條件下通過添加不同配比營養(yǎng)助劑模擬原位修復石油污染土壤,定期監(jiān)測土壤中石油烴降解、微生物菌群(數(shù)目和多樣性)以及脫氫酶的變化規(guī)律,為大面積生物修復石油污染土壤提供科學依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實驗材料

土壤取自山東省勝利油田濱一污水處理站的油泥.土壤在室溫背陰處風干,過 2 mm篩.采用常規(guī)方法分析土壤的有機質(zhì)、水解氮、速效磷等基本理化性質(zhì) (見表1).

NPK復合肥 (石家莊綠洲肥料有限公司)其中 N,P,K比例為 6∶5∶4.腐殖酸 (石家莊綠洲肥料有限公司)基本理化性質(zhì)如表1所示.諾沃肥 (諾維信 (中國)生物技術(shù)有限公司天津開發(fā)區(qū)分公司)是諾維信酶制劑公司發(fā)酵生產(chǎn)后的殘余液,再經(jīng)氫氧化鈣作用后的沉淀物,屬于生產(chǎn)廢棄物,含有大量N和 P等營養(yǎng)元素和鈣.諾沃肥經(jīng)風干過 2mm篩,其基本理化性質(zhì)見表1.

表1 土樣、腐殖酸、諾沃肥的理化性質(zhì)Table 1 Physical-chemical properties of the soil,humic acid and NovoGro

1.2 生物修復實驗

實驗設(shè)置 3個處理 1個對照,每個處理設(shè) 3個平行,每個處理土樣 700g.對照 (CK)不添加任何營養(yǎng)助劑;F組添加 NPK復合肥,調(diào)節(jié) C∶N為 10∶1;FL組添加 5%(W/W)諾沃肥-腐殖酸 (1∶1)混合物,并施加 NPK肥調(diào)節(jié) C∶N為 10∶1;FH組添加 10%(W/W)諾沃肥-腐殖酸 (1∶1),同上用 NPK復合肥調(diào)節(jié)至相同碳氮比.

所有處理組均置于人工氣候箱中恒溫培養(yǎng),溫度 25±1℃,光照/黑暗 (12 h/12 h),定期翻土保持土壤好氧狀態(tài),定期澆水保持土壤含水率為 20%(W/W).實驗周期為 60d,在 7,15,30,45和60d用四分法取樣測定各項指標.

1.3 實驗分析

稱重后的鋁盒內(nèi)加入適量潮濕土壤樣品,在 105℃下烘至恒重,計算土樣的含水率.采用重量法[7]測定土壤中的含油量.用稱重的平底燒瓶裝入適量二氯甲烷,樣品經(jīng)索氏萃取 24 h后,溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干,待溶劑充分揮發(fā)后再次對平底燒瓶稱重并計算土壤中的油含量.采用稀釋平板法測定總異養(yǎng)細菌數(shù),采用MPN法[8]測定土壤中石油烴降解菌數(shù).

脫氫酶活性的測定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[9],TTC在脫氫酶作用下會生成紅色的三苯基甲臜 (TPF).稱取 5 g土樣到具塞錐形瓶中,在瓶中加入 5 mL 0.4%TTC溶液.用同種土樣的滅菌土5 g,同上加入 TTC溶液作為對照.錐形瓶 37℃避光培養(yǎng) 24 h后加入少量甲醛中止反應,并加入 5 ml丙酮 37℃振蕩 10 min,轉(zhuǎn)入離心管 4000 r·min-1離心 5 min,取上清液在 485 nm波長下比色測定TPF生成量.脫氫酶活性大小用每克干土中生成的 TPF量來表征.

1.4 土壤樣品總 DNA提取、PCR擴增和變性凝膠梯度電泳 (DGGE)分析

采用 ZR土壤微生物DNA提取試劑盒 (ZY MO RESEARCH,U.S.A),提取土樣 DNA.得到土壤DNA樣品約為 100μl,于 -20℃保存.

將提取的土樣總 DNA作為聚合酶鏈反應 (PCR)的模板,采用細菌的 16SrRNA的 V3高變區(qū)通用引物進行擴增,所用的正向引物是 F357GC:

5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3’,

反向引物 R518:5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’,40個 GC夾加到 F338前面,以保證 DGGE實驗的穩(wěn)定和片斷的分離,這一對引物能夠擴增絕大多數(shù)細菌基因組的V3區(qū).

PCR反應體系包括 2μl模板、2μl的 10μmol·l-1引物、25μl的 2×Long Taq PCR Maste rMix(10 mmol·l-1Tris-HCl,50 mmol·l-1KCl,250μmol·l-1dNTP,1U Taq酶 ·10μl-1), 最后用雙蒸水補足至 50μl.

PCR反應程序如下:94℃ 5 min;前 20個循環(huán) 94℃ 60 s,65℃—55℃ 60 s,72℃ 3 min(其中每兩個循環(huán)溫度降 1℃),后 10個循環(huán)為 94℃ 60 s,55℃ 60 s,72℃ 3 min;最后 72℃ 7 min.

PCR產(chǎn)物進一步用變性梯度凝膠電泳 (DGGE)分離.凝膠變性梯度為 30%—60%.電泳緩沖液1×TAE,60℃,200V電泳 3—4 h.電泳結(jié)束后將凝膠進行銀染,用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照,Quantity One軟件分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 供試土壤的含油量及理化性質(zhì)

經(jīng)實驗測得,供試土壤的初始含油量高達 8.46%(即 84600 mg·kg-1),遠遠高于國家農(nóng)業(yè)標準臨界值 500 mg·kg-1[10].由表1可以看出,由于供試土壤含油量很高,因此土壤中有機碳含量相應也很高.研究表明,土壤環(huán)境中的營養(yǎng)元素 C和 N和 P之間的質(zhì)量比一般要達到 100∶10∶1時才能最好地滿足微生物生長,促進污染物的降解[11].供試土壤中生物可利用的 N和 P與微生物降解所需最佳 C,N和 P比例相比嚴重不足,因此選擇NPK復合肥作為營養(yǎng)助劑的主要部分,通過調(diào)節(jié)土壤的N和 P比例來滿足土壤中微生物的營養(yǎng)需求,增強土壤微生物活性、促進石油烴的降解.

2.2 修復實驗過程中土壤含油量變化

經(jīng)過 60d的修復實驗,各處理組含油量的變化情況見圖1.從圖1可以看出,4個處理的土壤含油量在 60d的修復實驗中有著不同程度的降低.對照 CK第 60d時石油烴降解率為 3.5%,這是土著微生物的降解和石油烴揮發(fā)所致.另外實驗過程中定期翻土保持好氧并補充水分,也起到刺激微生物生長的作用[12,13].添加了NPK復合肥的處理相比于對照石油烴降解率高出約 28%(F處理 60d降解率為 31.3%),通過調(diào)節(jié)土壤中 C/N的比例明顯起到了促進土著微生物降解石油烴的效果.

圖1 不同處理土壤中含油量隨時間變化●CK,▲F,◇FL,◆FHFig.1 Oil content changes in soilswith different treatments as a function of time

在用NPK肥調(diào)節(jié) C/N比的基礎(chǔ)上,添加 5%,10%的腐殖酸-諾沃肥分別將降解率提高到了39.5%和 37.9%.由于添加營養(yǎng)助劑的三個處理具有相同的 C/N比 (C/N為 10∶1),諾沃肥-腐殖酸能更好地促進土壤石油烴降解的原因可能有:(1)諾沃肥是酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)的廢棄物,本身含有大量容易被微生物利用的有機物,更能夠刺激土著微生物的生長.有研究表明除添加 N和 P等營養(yǎng)元素外,加入一些其它碳源底物 (co-substrates)如:市政下水道污泥、石油精煉廠污泥、葵花籽油、活性污泥等會對生物修復速率產(chǎn)生積極的影響[14]. (2)腐殖酸是植物死亡后在微生物與化學作用下形成的一種比較穩(wěn)定的天然大分子有機質(zhì),作為肥料腐殖酸除提供氮磷等營養(yǎng)物質(zhì)之外,還能吸附、交換和活化土壤中很多礦質(zhì)營養(yǎng)元素,如磷、鉀、鈣、鎂、鐵、硫以及微量元素等,使這些元素的有效性大大增加.另外腐殖酸分子內(nèi)含有多種活性官能團,具有親水性、吸附性和絡合性,因而又可以充當天然表面活性劑促進土壤中有機污染物的淋溶[15],已有研究將腐殖酸應用到石油污染土壤的修復之中,并起到一定的效果[16].由于諾沃肥和腐殖酸本身成分構(gòu)成的復雜性,以上兩條原因還有待實驗的進一步考證.不同添加量(5%,10%)對石油烴降解率沒有明顯的差別,在實際修復工作中由于經(jīng)濟因素和可操作性,大于 10%的濃度無法在實踐中進行,因而本研究中沒有考慮設(shè)置更高的濃度梯度.

2.3 修復實驗過程中土壤微生物數(shù)目的變化

表2列出 60d修復實驗中,各處理土壤總異養(yǎng)菌數(shù)和石油烴降解菌數(shù)的變化情況.從表2可以看出,對照在 60d的實驗中總異養(yǎng)菌數(shù)始終較低 (105—106CFU·g-1),添加營養(yǎng)助劑的三個處理總異養(yǎng)菌數(shù)明顯高于對照 (高 1—2個數(shù)量級).這說明調(diào)節(jié) C/N比確實起到了刺激土著微生物生長的效果.

不同處理組之間比較,施加諾沃肥-腐殖酸 5%(FL),10%(FH)的處理在第 7天時總異養(yǎng)菌數(shù)要高于 F處理.但在隨后的時間里,各處理總異養(yǎng)菌數(shù)相差不大.這可能是因為腐殖酸-諾沃肥中豐富的有機營養(yǎng)物質(zhì)及高含量的氮磷鉀營養(yǎng)元素在短期內(nèi)刺激土著菌大量繁殖,從而使石油烴的降解率在修復前期就顯示出較強優(yōu)勢.但 5%與 10%不同處理之間,總異養(yǎng)菌數(shù)沒有明顯的差別.

所有處理在修復前期 (前 30d內(nèi))總異養(yǎng)菌數(shù)目較高,隨后逐漸降低,與含油率下降先快后慢的變化趨勢相一致.開始時營養(yǎng)助劑充足,營養(yǎng)比例較為均衡,微生物生長迅速,石油烴降解速率快.隨著營養(yǎng)助劑的消耗,導致 C,N,P等營養(yǎng)比例失衡,石油烴降解速率變緩.因此,在實際修復工作中,相比于一次性添加營養(yǎng)助劑,多次定期添加應能達到更好的修復效果.修復過程中營養(yǎng)元素形態(tài)變化 (如氨態(tài)氮的增加)和微生物代謝過程中有毒物質(zhì)的積累也可抑制細菌的生長[6].

表2 不同處理土壤中總異養(yǎng)菌數(shù)和石油烴降解菌數(shù)的變化Table 2 Change of heterotrophic bacteria number and hydrocarbon degrader number in soilswith different treatments

各個處理土壤中石油烴降解菌數(shù)的變化總體趨勢與總異養(yǎng)菌數(shù)變化一致.表3列出了各個處理土壤中石油烴降解菌數(shù)占總異養(yǎng)菌數(shù)的比例變化.可以看到添加諾沃肥-腐殖酸的處理石油烴降解菌數(shù)所占比例要高于 F處理 (高 10% ±5%),這表明諾沃肥-腐殖酸中的某些成分可誘導石油烴降解菌的生長,進一步導致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化.值得注意的是原始土壤中石油烴降解菌數(shù) (4.7×106MPN·g-1)和石油烴降解菌的比例 (84.7%)已達到相當高的水平.研究表明[17],當土壤中內(nèi)源性烴降解菌高于 106CFU·g-1時,土壤中石油類污染物自身降解速度會較快,因此在這種石油烴降解菌數(shù)比較可觀的土壤中投加營養(yǎng)助劑進行生物刺激就可以起到良好的修復效果.

表3 不同處理土壤中石油烴降解菌數(shù)占總異養(yǎng)菌數(shù)的比例變化Table 3 Ratio of hydrocarbon degrader number to heterotrophic bacteria number in different treatment soils

2.4 修復實驗過程中土壤脫氫酶活性的變化

土壤脫氫酶活性也是反映微生物降解石油烴效率的重要指標[18].如圖2所示,添加營養(yǎng)助劑使得脫氫酶活性相比于對照顯著提高了 3—4倍.但由于土壤樣品的不均勻性平行樣之間的測量值誤差較大,NPK肥單獨添加與復合添加的處理之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異.結(jié)果表明,土壤脫氫酶活性、細菌數(shù)目與除油率的變化趨勢呈現(xiàn)明顯正相關(guān)性,能及時反映土壤微生物降解石油污染物的狀態(tài),是可用于實時監(jiān)測生物修復過程的敏感性指標.

2.5 修復實驗過程中土壤微生物種群多樣性的變化

本研究采用 PCR-DGGE技術(shù)對不同處理土壤在 7d和 24d時所得樣品進行微生物種群多樣性分析,DGGE指紋圖譜見圖3,其中左圖為凝膠相片,右圖為用 Quantity One處理得到的譜帶注解圖 (圖中CK為對照;編號 1,2,3依次為 F,FL和 FH三個處理 7d時的樣品;編號 4,5,6分別為 F,FL和FH處理 24d時的樣品).

根據(jù)DGGE對DNA的分離原理,圖譜上的條帶信息即可初步反映不同土壤的微生物種群多樣性及其構(gòu)成.由于凝膠相片的技術(shù)問題,圖3的注解圖中不包括空白土樣的譜帶.由圖3膠片可以看出,石油污染抑制了土壤微生物種群多樣性,而營養(yǎng)助劑的添加起到了一定恢復作用,表現(xiàn)為譜帶數(shù)目的增加.生物修復還提高了菌群的密度表現(xiàn)為譜帶亮度的提高.

圖3表明,種群多樣性按 FH-24d(100%)>FL-24d(91.5%)>F-24d(36.6%)>FH-7d(32.6%)>FL-7d(24.4%)>F-7d(8.9%)依次遞減.相比于 NPK肥單獨添加,諾沃肥-腐殖酸和NPK肥復合添加能更好地提高土壤微生物多樣性 (約為 3倍).從不同時間來看,7d時譜帶數(shù)目都要少于 24d時相應處理的譜帶數(shù)目 (約 3—4倍),表明修復前期土壤微生物的群落構(gòu)成變化最為頻繁.結(jié)合上述細菌數(shù)目、土壤脫氫酶活性指標,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在 30d左右趨于穩(wěn)定.

圖2 不同處理土壤中脫氫酶活性隨時間的變化●CK,▲F,◇FL,◆FHFig.2 Dehydrogenase activity in different treatment soils as a function of time

圖3 不同處理土樣 DGGE分離圖譜及示意圖Fig.3 DGGE profile of different treatment soils

3 結(jié)論

在實驗室條件下,考察了 NPK復合肥單獨添加、5%(W/W)諾沃肥-腐殖酸 (1∶1)與 NPK復合肥復合添加,以及 10%(W/W)諾沃肥-腐殖酸 (1∶1)與 NPK復合肥復合添加對土壤含油率、微生物菌群(數(shù)目和多樣性)以及土壤脫氫酶活性的影響.營養(yǎng)助劑的添加可顯著促進土壤中石油烴的降解.營養(yǎng)助劑添加方式之間,諾沃肥-腐殖酸與 NPK復合肥復合添加對石油烴的降解率要高于 NPK復合肥單獨添加 (高 8%左右),其原因可能是諾沃肥-腐殖酸可在短期內(nèi)提高土著微生物的活性,增加土壤中微生物的多樣性,增強石油烴的降解.諾沃肥-腐殖酸的兩個添加梯度 (5%和 10%)在本研究中未見明顯差別.三種營養(yǎng)助劑添加方式均能夠顯著提高土壤中總異養(yǎng)菌數(shù)、石油烴降解菌數(shù)、脫氫酶活性和微生物多樣性,且這 4個指標與土壤含油率變化呈正相關(guān).

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BI OREM ED IATI ON OF PETROLEUM CONTAM INATED SO I L BY VARI OUS NUTRIENT AM ENDM ENTS

Q IAO Jun CHEN W ei ZHANG Cheng-dong
(College of Environmental Science and Engineering,NankaiUniversity,Tianjin KeyLaboratory of Environmental Remediation and Pollution Control,KeyLaboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria atMinistry of Education,Tianjin,300071,China)

Under laboratory conditions,NPK fertilizer,NovoGro and humic acid were added to petroleum contaminated soil in differentproportions and their effectson bioremediation were evaluated.During the 60-day experiments,soil sampleswere collected and analyzed periodically to determine the oil content,heterotrophic bacteria number,hydrocarbon degrader number and dehydrogenase activity. In addition,PCR-DGGE was utilized to analyze the change of biodiversity during bioremediation.The results show that microorganism population,dehydrogenase activity and bacterial biodiversitywere significantly enhanced in the treatmentswith NPK fertilizer alone and the combined amendments(including NPK fertilizer,NovoGro and humic acid).After 60 days,the initial oil content(84600 mg·kg-1)was reduced by 31.3%—39.5% in nutrients amended soils,whereas it was only reduced by 3.5% in nonamended soil.Soil with combined amendment showed more efficient degradation than soilwith NPK fertilizer alone(about8%higher).The degradationmay be the results of the significantly enhanced microbial activity and biodiversity which were stimulated by NovoGro and humic acid addition.

petroleum,bioremediation,biostimulation,microbial activity,PCR-DGGE.

2009年5月9日收稿.

＊國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃)重點項目 (No.2007AA061200);天津市自然科學基金 (No.07JCYBJC16300);教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目.

＊＊通訊作者,E-mail:zhangchengdong@nankai.edu.cn