劉 榮，董 強(qiáng)，王向宏

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院食品科學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省自然資源研究所，黑龍江哈爾濱150040）

柳蒿芽黃酮抗氧化作用的研究

劉 榮1，董 強(qiáng)1，王向宏2

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院食品科學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省自然資源研究所，黑龍江哈爾濱150040）

研究了柳蒿芽黃酮對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化能力的影響，并采用單細(xì)胞凝膠電泳法測(cè)定柳蒿芽黃酮對(duì)H2O2引起的小鼠脾臟細(xì)胞DNA氧化損傷的防護(hù)作用。結(jié)果表明，柳蒿芽黃酮干預(yù)組小鼠比衰老模型組小鼠血清、肝臟、腦中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量明顯提高，丙二醛（MDA）含量明顯降低，與衰老模型組比較，差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01）。加入柳蒿芽黃酮組的小鼠脾臟細(xì)胞比對(duì)照組小鼠脾臟細(xì)胞DNA氧化損傷率明顯降低，損傷率從83.5%分別降為62.5%、53.0%、44.5%，差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01），柳蒿芽黃酮干預(yù)組DNA拖尾長度比對(duì)照組顯著降低（p＜0.05）。結(jié)果顯示，柳蒿芽黃酮具有明顯的抗氧化作用。

柳蒿芽黃酮，抗氧化，超氧化物歧化酶，谷胱甘肽過氧化物酶，丙二醛，DNA氧化損傷

柳蒿芽學(xué)名蔞蒿（Artemisin selengensis Turcz），菊科蒿屬植物，又名水蒿、香艾蒿等。全草有特異香，既可食用又可藥用，是一種開發(fā)前景較好的野生植物資源［1］。衰老是一種多環(huán)節(jié)的生物學(xué)過程，是機(jī)體在退化時(shí)期功能下降和紊亂的綜合表現(xiàn)。衰老的自由基學(xué)說認(rèn)為，衰老過程源于自由基對(duì)細(xì)胞及組織的損害，隨著年齡增長，機(jī)體的抗氧化活性逐漸降低，對(duì)自由基危害的防御能力也逐漸降低，從而導(dǎo)致機(jī)體的衰老和死亡［2］。而現(xiàn)在又普遍認(rèn)為自由基引起的DNA氧化損傷是生物變異和組織癌變的主要原因之一［3］。本研究旨在探討柳蒿芽黃酮對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化能力及對(duì)活性氧引起的細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷修復(fù)的影響，以考察柳蒿芽黃酮清除體內(nèi)自由基、防護(hù)自由基對(duì)機(jī)體造成損傷的效果，以期對(duì)柳蒿芽黃酮的藥物和功能性食品開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用昆明小鼠 雄性，兩月齡，體重20±2g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；柳蒿芽干品齊齊哈爾市烏裕爾河畔；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH沈陽沈一精細(xì)化學(xué)品公司，分析純；蘆丁對(duì)照品上?；瘜W(xué)試劑公司；過氧化氫 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，分析純；超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測(cè)試盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所；D-半乳糖、低熔點(diǎn)及正常熔點(diǎn)瓊脂糖 sigma公司；DMEM培養(yǎng)基 Gibco公司；胰蛋白酶 Difco公司；Triton X-100 美國Becton Dickison（B.D）公司。

722s可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 上海力申科學(xué)儀器有限公司；DYY-Ⅲ38A型水平電泳儀 北京六一儀器廠；DMIL型熒光顯微鏡 Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柳蒿芽黃酮的提取 將柳蒿芽干品粉碎，過60目篩，石油醚浸泡晾干，稱取25g，加入70%的乙醇1000mL，70℃水浴2h，超聲波輔助提取70min，離心，取上清液，加入Sevag試劑（正丁醇∶三氯甲烷= 1∶5）除蛋白，四倍醇沉過夜除多糖，離心、濃縮、真空冷凍干燥得柳蒿芽黃酮備用［4］。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.02g，加入50%的乙醇溶液定容至50mL。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于25mL容量瓶中，各加入5%的NaNO2溶液1mL，搖勻，靜置6min；加10%的Al（NO3）3溶液1mL，搖勻，靜置6min；加入4%的NaOH溶液10mL，加入50%的乙醇溶液定容，搖勻，靜置15min，在510nm處［5］測(cè)其吸光度。

圖1 蘆丁濃度（X軸）對(duì)吸光值（Y軸）的線性曲線

1.2.3 柳蒿芽黃酮對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠體內(nèi)的抗氧化作用

1.2.3.1 動(dòng)物分組 雄性小鼠50只，隨機(jī)均分成5組，自由攝食和飲水。衰老組皮下注射D-半乳糖200mg/kg·d bw，同時(shí)灌胃等量生理鹽水；對(duì)照組給予等量的生理鹽水；柳蒿芽黃酮組皮下注射D-半乳糖200mg/kg·d bw，同時(shí)分別灌胃50、100、200mg/kg·d bw柳蒿芽黃酮。實(shí)驗(yàn)期42d，于末次給藥1h后，眼眶取血于離心管中，3000r/min離心取血清，再分別取腦、肝臟，勻漿器勻漿，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 指標(biāo)測(cè)定 血清、腦和肝臟勻漿中 SOD、GSH-Px、MDA含量的測(cè)定均參照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的測(cè)定試劑盒說明書。

1.2.4 柳蒿芽黃酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷修復(fù)的影響1.2.4.1 單細(xì)胞制備 取小鼠脾組織，加入PBS，冰浴中500～800r/min勻漿5～10s，胰蛋白酶消化，過分樣篩取濾液，2000r/min離心10min去上清，加入PBS吹散沉淀于離心管底的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1× 107/mL，接種于含10%胎牛血清、100μg/mL鏈霉素、100U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。每天取出一定細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞存活率，確定最佳實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

1.2.4.2 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，柳蒿芽黃酮作用組分別加入20、50、100μg/mL柳蒿芽黃酮，作用24h后與H2O2對(duì)照組同時(shí)加入40μmol/L H2O2作用30min，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2遍，胰蛋白酶消化，將細(xì)胞制成懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL。

1.2.4.3 單細(xì)胞凝膠電泳 參照Singh等［6］的方法，在完全磨砂的載玻片上，滴加85μL 1%正常熔點(diǎn)的瓊脂糖（不含Ca2+、Mg2+，50℃），蓋上蓋玻片，置于4℃下10min至凝；移去蓋玻片，將細(xì)胞懸液與1%低熔點(diǎn)瓊脂糖（37℃）1∶1混合共70μL作為第二層，蓋上蓋玻片，置于4℃下10min至凝；移去蓋玻片，將75μL 0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖（37℃）作為第三層，4℃下10min至凝。移去蓋玻片，將載玻片浸入4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液（2.5mol/L NaCl，100mmol/L Na2EDTA，10mmol/L Tris，1%十二烷基肌氨酸鈉，pH10，用前加入1%Triton-100和10%DMSO）中2h。將載玻片取出，電泳液沖洗后，并列置于水平電泳槽中，電泳槽中盛有新配制的堿性電泳緩沖液（1mmol/L Na2EDTA，300mmol/L NaOH），電泳液約超過載玻片膠面0.25cm左右，放置40min，使DNA充分解螺旋。室溫下電泳40min（電壓25V、電流300mA）。電泳后用0.4mol/L Tris pH7.5浸洗三次，每次10min。

1.2.4.4 染色與觀察 每個(gè)載玻片滴加50μL濃度為5μg/mL的溴化乙錠水溶液，染色20min。熒光顯微鏡下觀察，從每張載玻片中隨機(jī)選取100個(gè)細(xì)胞，共觀察2次，對(duì)可重復(fù)結(jié)果選1次為代表，計(jì)算細(xì)胞損傷率。從每組損傷細(xì)胞中隨機(jī)挑選20個(gè)細(xì)胞，測(cè)定DNA拖尾長度。

2 結(jié)果與討論

2.1 柳蒿芽黃酮對(duì)衰老模型小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）含量的影響

表1顯示，在D-半乳糖的作用下，衰老組小鼠與正常組比較，血清、肝臟、腦中的SOD含量明顯下降，其中腦中SOD含量差異顯著（P＜0.05），血清和肝臟中SOD含量差異極顯著（p＜0.01），說明衰老模型建立成功。血清、肝臟柳蒿芽黃酮低、中劑量組與腦柳蒿芽黃酮高劑量組SOD含量顯著高于衰老組（P＜0.05），血清、肝臟柳蒿芽黃酮高劑量組SOD含量極顯著高于衰老組（P＜0.01），說明柳蒿芽黃酮可以明顯提高衰老模型小鼠體內(nèi)SOD的含量。

2.2 柳蒿芽黃酮對(duì)衰老模型小鼠體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量的影響

表2顯示，衰老組小鼠與正常組比較，血清、肝臟、腦中的 GSH-Px含量都明顯下降，差異極顯著（p＜0.01）。血清、腦柳蒿芽黃酮低、中劑量組GSH-Px含量顯著高于衰老組（P＜0.05），血清、腦、肝臟柳蒿芽黃酮高劑量組，肝臟柳蒿芽黃酮中劑量組GSH-Px含量極顯著高于衰老組（P＜0.01），說明柳蒿芽黃酮可以明顯提高衰老模型小鼠體內(nèi)GSH-Px的含量。

2.3 柳蒿芽黃酮對(duì)衰老模型小鼠體內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響

表3顯示，衰老組小鼠與正常組比較，血清、肝臟、腦中的MDA含量明顯上升，其中腦中MDA含量差異顯著（P＜0.05），血清和肝臟中MDA含量差異極顯著（p＜0.01）。血清柳蒿芽黃酮低、中劑量組與肝臟、腦柳蒿芽黃酮中、高劑量組MDA含量顯著低于衰老組（P＜0.05），血清柳蒿芽黃酮高劑量組MDA含量極顯著低于衰老組（P＜0.01），說明柳蒿芽黃酮可以明顯降低衰老模型小鼠體內(nèi)MDA含量。

2.4 柳蒿芽黃酮對(duì)小鼠細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷修復(fù)的影響

表1 柳蒿芽黃酮對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠血清、肝臟、腦中SOD含量的影響（±s，n=10）

表1 柳蒿芽黃酮對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠血清、肝臟、腦中SOD含量的影響（±s，n=10）

注：a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與對(duì)照組比較，P＜0.01。表2、表3同。

柳蒿芽黃酮濃度（mg/kg·d） 血清（U/mL） 肝臟（U/mg prot） 腦（U/mg prot）正常組 246.81±80.37b 240.29±86.14b 138.25±68.36a衰老組 174.71±19.53 176.62±40.18 105.86±36.44 50 223.98±84.32a 205.48±80.81a 119.44±115.03 100 249.87±90.09a 217.98±54.46a 126.94±62.08a 200 275.99±113.26b 239.59±65.96b 131.28±54.26a

表2 柳蒿芽黃酮對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠血清、肝臟、腦中GSH-Px含量的影響（±s，n=10）

表2 柳蒿芽黃酮對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠血清、肝臟、腦中GSH-Px含量的影響（±s，n=10）

柳蒿芽黃酮濃度（mg/kg·d） 血清（U/mL） 肝臟（U/mg prot） 腦（U/mg prot）正常組 259.36±62.18b 434.57±91.38b 309.77±81.64b衰老組 166.24±49.27 263.22±59.49 186.51±47.38 50 187.48±51.39a 317.91±64.26b 224.97±56.78a 100 216.53±64.44a 352.65±70.18b 257.24±61.22a 200 241.64±178.68b 389.51±88.29b 293.19±75.26b

表3 柳蒿芽黃酮對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠血清、肝臟、腦中MDA含量的影響（±s，n=10）

表3 柳蒿芽黃酮對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠血清、肝臟、腦中MDA含量的影響（±s，n=10）

柳蒿芽黃酮濃度（mg/kg·d） 血清（U/mL） 肝臟（U/mg prot） 腦（U/mg prot）正常組 26.33±3.76b 36.26±15.79b 43.24±18.39a衰老組 46.56±7.97 81.37±40.28 86.66±43.47 50 40.47±5.22a 69.55±31.67 61.78±32.65 100 35.74±4.69a 57.11±34.53a 55.43±22.56a 200 28.32±4.11b 43.61±15.22a 48.97±15.32a

表4顯示，柳蒿芽黃酮干預(yù)組細(xì)胞拖尾率明顯低于陽性對(duì)照組，其中柳蒿芽黃酮高劑量組差異顯著（P＜0.05），柳蒿芽黃酮低、中劑量組差異極顯著（P＜0.01），柳蒿芽黃酮低、中劑量組拖尾長度顯著低于陽性對(duì)照組（P＜0.05），說明柳蒿芽黃酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷有修復(fù)效果。柳蒿芽黃酮高劑量組對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷的修復(fù)效果沒有柳蒿芽黃酮中、低劑量組效果好，說明柳蒿芽黃酮濃度超過一定限度后會(huì)減弱對(duì)細(xì)胞DNA氧化損傷的修復(fù)效果。

表4 柳蒿芽黃酮對(duì)小鼠脾臟細(xì)胞DNA氧化損傷的修復(fù)影響

注：a：與H2O2組比較，P＜0.05；b：與H2O2組比較，P＜0.01。

3 結(jié)論

D-半乳糖致衰老模型的原理是由于注射D-半乳糖導(dǎo)致體內(nèi)半乳糖濃度增高，并在醛糖還原酶的催化下，還原成半糖醇并堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響細(xì)胞的正常滲透壓，導(dǎo)致機(jī)體衰老［7］。本研究中，D-半乳糖建立的衰老組模型小鼠血清、肝臟、腦中SOD、GSH-Px含量與正常對(duì)照組比較明顯降低，MDA含量明顯提高，結(jié)果具有顯著性差異（P＜0.05）和極顯著性差異（P＜0.01），這些結(jié)果與國內(nèi)王少康［8］等人、王懷穎［9］等人報(bào)道的D-半乳糖老化模型小鼠體內(nèi)抗氧化能力評(píng)價(jià)結(jié)果相一致，說明本研究衰老模型具有可靠性。

研究表明，SOD、GSH-Px活力與MDA含量是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)［10］。本研究中，柳蒿芽黃酮干預(yù)組小鼠血清、肝臟、腦中SOD、GSH-Px活力與衰老模型組比較明顯偏高，MDA含量明顯偏低，結(jié)果具有顯著性差異（P＜0.05）和極顯著性差異（P＜0.01），說明柳蒿芽黃酮可不同程度地提高D-半乳糖老化模型小鼠體內(nèi)兩種主要抗氧化酶SOD與GSH-Px的活力，降低MDA的含量，證明了柳蒿芽黃酮可以延緩由于注射D-半乳糖所導(dǎo)致的小鼠老化現(xiàn)象，提高老化模型小鼠體內(nèi)抗氧化的能力。

近年來，有關(guān)活性氧的產(chǎn)生及其對(duì)生物分子的損傷機(jī)理研究受到各學(xué)科的普遍重視［11］。如吳文林等［12］報(bào)道茶多酚、蘆丁、黃芩甙等3種黃酮類化合物對(duì)羥基自由基引發(fā)的DNA氧化損傷具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用表現(xiàn)在它們能使DNA發(fā)光強(qiáng)度減弱、發(fā)光峰值延遲，并能保護(hù)質(zhì)粒DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的斷裂。

本研究中通過單細(xì)胞凝膠電泳法考察了柳蒿芽黃酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷的修復(fù)作用，與陽性對(duì)照組比較其抑制由于氧化損傷所造成的細(xì)胞DNA拖尾現(xiàn)象十分明顯，最高可降低細(xì)胞拖尾率達(dá)到39%，還可明顯降低氧化損傷細(xì)胞DNA的拖尾長度，效果顯著（P＜0.05）。以上結(jié)果證明了柳蒿芽黃酮具有較好的抑制由活性氧造成的細(xì)胞DNA氧化損傷的能力。這一結(jié)論對(duì)于柳蒿芽黃酮的開發(fā)利用及黃酮類化合物抗氧化作用機(jī)制的研究有一定參考價(jià)值。

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Study on the antioxidant activity of flavonoid in Artemisin selengensis

LIU Rong1，DONG Qiang1，WANG Xiang-hong2
（1.Department of Food Science in Forestry College of Northeast Forest University，Harbin 150040，China；2.Natural Resource Institute of Heilongjiang，Harbin 150040，China）

The antioxidant and protective effect of flavonoids in Artemisin selengensis in aged mice caused by D-galactose and in DNA oxidative damage induced by H2O2was investigated in this research.The results indicated that the activities of SOD and GSH-Px in serum，liver and brain in aged mice of the group which treated with flavonoid in Artemisin selengensis were significantly higher and the content of MDA was significantly lower than the aged model group（P＜0.05，P＜0.01）.The damage ratio of splenic cells of the group which treated with flavonoid in Artemisin selengensis was significantly lower than the positive control group（P＜0.05，P＜0.01），and was reduced from 83.5%to 62.5%，53.0%，44.5%.The comet length of the group which treated with flavonoid in Artemisin selengensis was significantly lower than the positive control group（P＜0.05）.The results showed that flavonoids in Artemisin selengensis had obvious antioxidant effect.

flavonoids in Artemisin selengensis；oxidation resistance；SOD；GSH-Px；MDA；DNA oxidative damage

TS201.1

A

1002-0306（2010）12-0319-04

2009-10-26

劉榮（1971-），女，博士，副研究員，研究方向：功能食品。