劉曉健 趙玉定 趙松蘭

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 江蘇 鎮(zhèn)江 202002)

解脲支原體(UU)是女性生殖器感染的重要致病因子,可導(dǎo)致胎膜早破、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)感染、產(chǎn)褥期感染等。本研究探討UU的致病因素脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMPs)刺激絨毛膜產(chǎn)生的hBD-2表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 凍干Uu3標(biāo)準(zhǔn)株

由中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 解脲支原體菌液接種于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,傳代2～3次后提取其LAMPs。

1.3 LAMPs提取

按照有關(guān)參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行,對(duì)數(shù)期的UU培養(yǎng)液離心后,沉渣置入37℃水浴箱中孵育使其發(fā)生相分離,第二次相分離結(jié)束,收集沉淀LAMPs,BCA測(cè)定蛋白濃度后備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

取自10例健康的因社會(huì)因素晚孕引產(chǎn)婦女絨毛膜組織,將其剪碎成糊狀在冰生理鹽水中反復(fù)吹洗后稱(chēng)取組織(濕重)300mg,均勻接種于培養(yǎng)瓶。

1.5 培養(yǎng)液為高糖型條件下培養(yǎng)24h,除去未貼壁細(xì)胞并換入新鮮培養(yǎng)液。每日更換培養(yǎng)液,原代的細(xì)胞80%匯合后,PBS洗1次,胰蛋白酶消化后,吹打成單細(xì)胞,以1.0×105/mL接種于新的培養(yǎng)皿傳代培養(yǎng)。

1.6 LAMPS刺激試驗(yàn)

絨毛膜細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)板6孔板中密度為5×105/mL,每孔細(xì)胞加入不同濃度(0,0.1,1,2,3ug/L)的LAMPS加以刺激,提取細(xì)胞總RNA及細(xì)胞胞漿蛋白,每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)。

1.7 RT-PCR檢測(cè)hBD-2 mRMA表達(dá)

上皮細(xì)胞總RNA的提取采用上海飛捷生物公司的總RNA極速抽提試劑盒,按其說(shuō)明進(jìn)行。 引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank hBD-2cDNA序列,設(shè)計(jì)特經(jīng)檢查擴(kuò)增片段均跨躍內(nèi)含子hBD-2跨內(nèi)含子引物:上游5-CCA GCC ATC AGC CAT GAG GGT-3, 下游5-GGA G CC CTT TCT GAA TCC GCA-3, 產(chǎn)物長(zhǎng)255bp,符合內(nèi)參照,擴(kuò)增片長(zhǎng)度為RT-PCR要求,同時(shí)用PCR試劑盒里看家基因GAPDH引物為544bp。RT-PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳,紫外線下觀察結(jié)果,并攝相。取誘導(dǎo)因素刺激過(guò)的細(xì)胞提取總蛋白,測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,電泳hBD-2蛋白,電轉(zhuǎn)印后Western blotting檢測(cè),出現(xiàn)條帶后觀察、照相。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

LAMPs能明顯誘導(dǎo)絨毛膜產(chǎn)生hBD-2,HBD-2mRNA表達(dá)與LAMPs濃度呈明顯的劑量依賴(lài)性。相同濃度的 LAMPS刺激絨毛膜12h,24h后絨毛膜的HBD-2mRNA表達(dá)呈現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性。用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析表中數(shù)據(jù),LAMPs與細(xì)胞內(nèi)sBD-2基因相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系,P<0.05顯著差異,添加不同濃度LAMPs,sBD-2基因的相對(duì)表達(dá)量均有顯著差異,其中添加LAMPs3μg/mL與LAMPs0.1μg/mL之間差異極顯著,而且2個(gè)不同培養(yǎng)時(shí)間之間略有差異。結(jié)果表明在較低的濃度下,LAMPs濃度與sBD-2基因相對(duì)表達(dá)量變化基本呈正相關(guān)。

表1 添加不同濃度LAMPs對(duì)絨毛膜sBD-2基因在不同時(shí)間表達(dá)的影響

3 討論

UU缺乏細(xì)胞壁,細(xì)胞膜是UU與外界環(huán)境發(fā)生相互作用的唯一結(jié)構(gòu),細(xì)胞膜由脂質(zhì)雙層和膜蛋白組成,一類(lèi)為膜本體蛋白,另一類(lèi)外周膜蛋白。膜本體蛋白和外周膜蛋白統(tǒng)稱(chēng)為脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMPS),是暴露在表面與周?chē)h(huán)境各種成分不斷相互作用因是影響機(jī)體免疫系統(tǒng)的一種主要蛋白。該膜蛋是介導(dǎo)支原體黏附宿主細(xì)胞表面,進(jìn)入侵宿主細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞受損與死亡的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此對(duì)支原體LAMPS的研究是了解UU入侵宿主后與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的關(guān)鍵。孕期UU感染與胎膜早破密切相關(guān)[1],而支原體感染者發(fā)生胎膜早破是正常分娩者的8倍[2]。宮內(nèi)感染UU造成絨毛受損,最終導(dǎo)致妊娠終止,其機(jī)制可能與Uu產(chǎn)生的磷酯酶A、C促使細(xì)胞膜中游離的花生四烯酸釋放,而花生四烯酸是前列腺素的必需前體物質(zhì),能損傷胚胎組織及其附屬物而影響妊娠結(jié)局[3]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)Uu產(chǎn)生的高分子質(zhì)量物質(zhì)能刺激宿主免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生釋放多種細(xì)胞因子而造成絨毛膜的局部免疫損傷,這些都可以導(dǎo)致病理妊娠的發(fā)生。

防御素2在正常女性陰道、子宮頸、子宮內(nèi)膜、輸卵管、卵巢、絨毛膜、絨毛及胎盤(pán)組織中廣泛表達(dá)[4],提示防御素2的基因表達(dá)調(diào)控、生物學(xué)活性對(duì)于維系正常婦女及孕婦生殖道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、宿主天然抗感染機(jī)制中起著重要的作用。宮頸粘液具有強(qiáng)大而廣譜的抗菌活性,防御素在子宮頸組織中固有表達(dá),是子宮頸抗感染作用的重要介質(zhì)[5]。

β-防御素毫摩爾濃度時(shí)具有殺傷細(xì)菌的能力,納摩爾濃度時(shí)就具有趨化活性,具有間接的免疫啟動(dòng)作用,在較低的分子濃度下,β-防御素能夠與這些細(xì)胞表面特異性的趨化因子受CCR6相結(jié)合,趨化這些細(xì)胞朝著受致病微生物侵襲的皮膚或粘膜病灶部位遷移,從而提高機(jī)體抵抗微生物感染的獲得性免疫反應(yīng)水平。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β-防御素-2在正常產(chǎn)婦絨毛膜組織中表達(dá)量較低,LAMPs能明顯誘導(dǎo)絨毛膜產(chǎn)生hBD-2,HBD-2mRNA表達(dá)與LAMPs濃度與刺激時(shí)間呈明顯的依賴(lài)性。Ganz等在純化的防御素對(duì)人及小鼠腫瘤的作用中發(fā)現(xiàn),其活性由微絲、鈣調(diào)節(jié)蛋白和溶酶體調(diào)節(jié),裂解作用呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。目前在對(duì)β-防御素表達(dá)分泌量的影響、作用機(jī)理研究還不很清楚,有待進(jìn)一步研究。

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