吳鵬等

[摘要] 目的 采用異硫氰酸熒光素標(biāo)識(shí)Ⅳ型膠原單克隆抗體，為直接或間接熒光方法檢測(cè)人體肝臟或血液中Ⅳ型膠原含量奠定基礎(chǔ)。 方法 采用直接透析方法進(jìn)行熒光素標(biāo)識(shí)，標(biāo)識(shí)后通過(guò)Sephadex G25凝膠過(guò)濾，除去多余的熒光素和其他雜質(zhì)，獲得標(biāo)識(shí)熒光抗體純品。經(jīng)SDS-PAGE和雙向免疫擴(kuò)散凝膠電泳，對(duì)標(biāo)識(shí)抗體進(jìn)行純度，熒光特性，抗體特異性進(jìn)行檢測(cè)鑒定。 結(jié)果 經(jīng)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光熒光圖像分析儀檢測(cè)SDS-PAGE電泳結(jié)果，激發(fā)波490nm，發(fā)射波510nm，在150KD處有一條黃綠熒光帶，其他處未見(jiàn)條帶出現(xiàn)，凝膠圖像分析儀檢測(cè)純度達(dá)96%；免疫瓊脂雙向擴(kuò)散電泳結(jié)果顯示，標(biāo)識(shí)抗體與未標(biāo)識(shí)抗體與抗原之間均有乳白色沉淀線(xiàn)，且沉淀物含量一致，熒光分析儀檢測(cè)標(biāo)識(shí)抗體與中心孔之間有黃綠色熒光條帶。 結(jié)論 采用本研究方法制備的熒光抗體具有純度高、熒光性好、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，為臨床檢測(cè)人體Ⅳ型膠原含量提供便利。

[關(guān)鍵詞] Ⅳ型膠原；熒光抗體；熒光素；FITC

[中圖分類(lèi)號(hào)] R392 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）01-37-03

[Abstract] Objective To lay the foundation of detecting the content of Ⅳ type collagen in human liver or blood through direct or indirect fluorescent method， Identifying monoclonal antibody of collagen typeⅣ by using the fluorescein isothiocyanate. Methods Using a direct dialysis method to identification of fluorescein. The purity of the identifying fluorescent antibody were obtained by Sephadex G-25 gel filtration column， which remove excess fluorescein and other impurities. The purity， fluorescence characteristic and specificity of antibody were measured with SDS-PAGE and double immune diffusion gel electrophoresis. Results The results of SDS-PAGE electrophoresis were measured by fully automatic chemiluminescence fluorescence image analyzer. Eexcitation wave 490nm and emission wave 510nm. The purified of antibody were shown only one strap of yellow with green fluorescence and the molecular weight （MW） of them were estimated to be approximately 150kD， its purity was 96%， there were not any other strap. The result of double agar gel immune-diffusion test showed that both identify antibodies and not identify antibody were combination with antigen， all of product were formed milky white precipitation lines of antigen-antibody complexes with antigen. And the sediment content was consistent. There was a strap of yellow with green fluorescence in the center hole by fluoroanalyzer. Conclusion In this study， the fluorescent antibody against human collagen type Ⅳ with high purity and strong specificity was produced by separation and purification methods， which provide convenience for clinical detection of the human body Ⅳ type collagen.

[Key words] Collagen type Ⅳ； Fluorescent antibody； Fluorescein isothiocyanate； FITC

免疫熒光技術(shù)是免疫檢測(cè)技術(shù)中的一種。這種技術(shù)是將熒光示蹤物質(zhì)與抗體結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性，進(jìn)行組織、細(xì)胞或體液內(nèi)抗原物質(zhì)的檢測(cè)[1]。免疫熒光技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的檢測(cè)中[2]。Ⅳ型膠原（ColⅣ）主要存在于各器官的基底膜中，是基底膜的微量成分，很多具有增生性質(zhì)的疾病，ColⅣ含量與病變程度呈正相關(guān)；特

別是在肝纖維化的診斷和分型方面，ColⅣ在體內(nèi)和組織中含量的檢測(cè)更為重要[3-4]。本研究采用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)識(shí)Ⅳ型膠原單克隆抗體，同時(shí)對(duì)標(biāo)識(shí)后抗體的熒光性及特異性進(jìn)行鑒定分析[5]，為建立直接熒光和間接熒光檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

X100冷凍高速離心機(jī)（HITACHI）、LP型低壓層析系統(tǒng)（BIO-RAD）、2000C微量紫外可見(jiàn)光檢測(cè)儀（Thermoscientific）、F-4600熒光分光光度計(jì)（Hitachi）、2500+藍(lán)光凝膠分析儀（上海天能）、5500multi+RGB全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光熒光圖像分析儀（上海天能公司）。

1.2 主要試劑

Ⅳ型膠原抗體（本實(shí)驗(yàn)室制備）、Sephadex G25凝膠填料（GE）、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）（Sigma公司）、其他試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.3 FITC標(biāo)記Ⅳ型膠原抗體的制備和純化

采用透析法標(biāo)記、凝膠過(guò)濾法純化[6-7]。取抗體溶液10mL，抗體含量為9mg，充分溶解。15000g/min，4℃，離心20min。棄上清，沉淀溶解于4mL pH9.8 NaHCO3緩沖液中，吹打混勻，溶液置透析袋中對(duì)上述緩沖液，4℃，透析6h，期間3次更換透析外液，透析過(guò)程在輕柔攪拌中進(jìn)行。透析結(jié)束，透析內(nèi)液5000g/min，4℃離心20min。取上清，微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)抗體含量為1.62mg/mL。上清裝入透析袋，置熒光標(biāo)識(shí)液（200mL pH 9.8NaHCO3緩沖液+FITC 20mg至終濃度為0.1mg/L），避光4℃透析過(guò)夜。置透析袋于PBS中，終止反應(yīng)透析10h，期間數(shù)次更換PBS至檢測(cè)480nm吸光值為零。取葡聚糖凝膠（SephadexG-25）10g，溶于去離子水中12h后裝柱。柱長(zhǎng)1.5×30cm，200mL PBS平衡柱，將標(biāo)識(shí)抗體溶液應(yīng)用于SephadexG-25層析柱，流速0.2mL/min，餾分體積5mL/tube，紫外280nm監(jiān)測(cè)，收集第一峰，體積為15mL；抗體濃度為0.51mg/mL。分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光抗體的鑒定

1.4.1 標(biāo)識(shí)抗體的熒光特性及純度測(cè)定 采用SDS-PAGE電泳及凝膠分析儀、凝膠熒光分析儀鑒定標(biāo)識(shí)抗體的熒光特性[8]。SDS-PAGE非還原性凝膠電泳（樣品緩沖液中不添加β-巰基乙醇），分離膠10%，濃縮膠3%，恒壓200V電泳2h。剝離膠板，蒸餾水浸洗2min，RGB多色熒光分析儀檢測(cè)。熒光檢測(cè)結(jié)束后，膠板用R-250考馬斯亮藍(lán)（0.25%）染色后，凝膠成像儀觀察。

1.4.2 標(biāo)識(shí)的熒光抗體特異性測(cè)定 采用凝膠免疫雙向電泳檢測(cè)法[9]。0.9%鹽水瓊脂糖制備瓊脂板；待瓊脂凝固后，打孔器打孔，孔徑3mm，孔距10mm；加樣，1孔加純化后熒光抗體溶液（0.3mg/mL）、2孔加入未標(biāo)識(shí)抗體溶液（0.3mg/mL）、3孔加入生理鹽水對(duì)照、中心孔加入Ⅳ型膠原（0.5mg/mL）；每孔加樣品20μL；瓊脂板玻片置37℃溫箱中12h。

2 結(jié)果

2.1 熒光抗體熒光特性和純度

5500multi+RGB全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光熒光圖像分析儀檢測(cè)電泳結(jié)果，激發(fā)波490nm，發(fā)射波510nm，標(biāo)識(shí)抗體在150KD有一條黃綠色熒光帶，其他的位置未見(jiàn)條帶出現(xiàn)；凝膠經(jīng)染色后，凝膠成像儀檢測(cè)可見(jiàn)標(biāo)識(shí)、未標(biāo)識(shí)抗體在150KD處均有一條帶，其他處有染色較淺的散在條帶（圖1）。凝膠分析儀分析標(biāo)識(shí)抗體純度為96%。

3 討論

免疫熒光技術(shù)是利用熒光素對(duì)抗體（抗原）進(jìn)行標(biāo)記，之后用于免疫檢測(cè)。近年來(lái)，免疫熒光技術(shù)迅速發(fā)展，以其靈敏度高，準(zhǔn)確性強(qiáng)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和臨床診斷[10]?？贵w的熒光標(biāo)識(shí)效果決定了熒光檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，決定標(biāo)識(shí)效果的因素除了熒光素偶聯(lián)的程度，更重要的是標(biāo)識(shí)抗體的純度[11]。本研究采用透析標(biāo)識(shí)法連接熒光素和抗體。采用Sephadex G25柱層析去除未標(biāo)記的熒光素和雜質(zhì)，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定其層析流速為0.2mL/min。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示標(biāo)記抗體純度達(dá)到96%。經(jīng)RGB多色熒光分析儀分析結(jié)果，標(biāo)識(shí)后的抗體，在激發(fā)熒光490nm，發(fā)射波510nm處可見(jiàn)黃綠色熒光，符合FITC熒光素的熒光特性[12]。采用免疫雙向凝膠電泳方法檢測(cè)標(biāo)識(shí)熒光抗體的特異性，結(jié)果顯示1孔和2孔與中心孔之間均有沉淀線(xiàn)形成，且線(xiàn)的粗細(xì)程度基本相同。經(jīng)熒光分析儀檢測(cè)，可見(jiàn)1孔與中心孔之間有黃綠色線(xiàn)狀熒光。

綜上所述，本方法在常規(guī)透析標(biāo)識(shí)后經(jīng)Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析后，可有效去除未連接的熒光素和其他雜質(zhì)，進(jìn)而保證了標(biāo)識(shí)后抗體的純度。標(biāo)識(shí)后抗體的特異性從雙向擴(kuò)散免疫電泳結(jié)果分析，基本沒(méi)有損失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明經(jīng)本方法可獲得純度高，特異性強(qiáng)的Ⅳ型膠原熒光抗體。為臨床采用直接和間接熒光法檢測(cè)人體Ⅳ型膠原，提供了方便條件，為臨床早期診斷肝纖維化奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2014-10-21）