郭兆安　孟凡辰　于春江

[摘要] 目的 觀察芪蛭降糖膠囊對糖尿病腎?。―N）大鼠腎臟結構和功能的影響。 方法 48只清潔級雄性Wistar大鼠按體重隨機抽取40只，采用切除右腎加腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法制備DN模型，造模成功后按24hTP高低，兩頭隨機抽取分為模型組、纈沙坦對照組、芪蛭降糖膠囊低劑量組、芪蛭降糖膠囊高劑量組。另取8只大鼠行右腎假切術，腹腔注射等量檸檬酸緩沖液作為假手術組。成模2d起各組給予相應濃度和劑量的藥物，給藥12周時觀察DN大鼠24h尿蛋白定量（24hUPQ）、α1微球蛋白（α1-MG）、β2-微球蛋白（β2-MG）和血糖（BS）、血清肌酐（Scr）、血清胱抑素-C（Cystatin-C）的變化；測定血漿血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）；留取標本后處死所有動物，腎組織行HE染色、PAS染色、免疫組化染色，光鏡下觀察腎組織病變，PAS染色計算腎小球硬化指數(shù)（GSI）、腎間質纖維化指數(shù)（IF），電鏡觀察腎小球毛細血管超微結構；免疫組化檢測腎組織轉化生長因子（TGF）-β1的表達。 結果 12周后，模型組大鼠24hUPQ、α1-MG、β2-MG較假手術組顯著增多（P<0.01），3個治療組DN大鼠的24hUPQ、α1-MG、β2-MG較模型組明顯減少（P<0.01），2個中藥治療組較對照組也明顯減少（P<0.05～0.01），且呈劑量依賴性；模型組大鼠BS、Scr、Cystatin-C亦較假手術組顯著升高（P<0.01），2個中藥治療組較模型組也明顯降低（P<0.05～0.01），對照組BS與模型組相比無明顯變化（P>0.05）。3個治療組血漿AngⅡ、ET-1較模型組顯著降低、NO顯著升高（P<0.05～0.01）。HE染色顯示，2個中藥治療組大鼠腎組織病理損害明顯減輕，PAS染色顯示2個中藥治療組大鼠腎組織GSI、IF顯著減輕（P<0.01）。電鏡觀察顯示，2個中藥治療組DN大鼠腎小球基底膜增厚和系膜增生、足細胞足突融合減輕。免疫組化檢查顯示2個中藥治療組DN大鼠腎組織TGF-β1的表達顯著下調(diào)（P<0.01）。 結論 芪蛭降糖膠囊通過抑制AngⅡ的分泌，減輕血管內(nèi)皮損傷，下調(diào)TGF-β1在腎組織的表達，減輕腎小球硬化和腎間質纖維化，改善腎組織病理損害，從而對DN起到治療作用。

[關鍵詞] 糖尿病腎??；芪蛭降糖膠囊；轉化生長因子-β1；血管內(nèi)皮損傷

[中圖分類號] R277.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）01-31-06

[Abstrac] Objective To study effect of Qizhi Jiangtang Capsule （QJC） on renal structure and function of kedney in DN rats. Methods 48 male Wistar rats were randomLy divided into 5 groups（n=8）： the sham operation group，the model group，Valsartan group （control group）， the low-dosage of QJC group （low dosage group） and high dosage of QJC group （high dosage group）. Except the rats in the sham operation group，the other rats were established DN animal model by removal of the right kidney with intraperitoneal injection of STZ.Medicine was given to each group according to the designed concentration and dosage from 2 days of the model established. 24hUPQ， α1-microglobulin（α1-MG），β2- microglobulin（β2-MG）and serum creatinine（Scr）， Cystatin-C of DN rats were observed at 12th week. AngⅡ、ET-1 and NO were detected ，too. The kidney tissues was stained respectively by HE，PAS and immunohistochemical.Histological change in the kidney tissues was observed by HE stain. GSI and IF were calculated by PAS stain.Glomerular capillary ultrastructure was observed by electron microscopy. The expression of TGF-β1 was detected by immunohistochemical. Results At 12th week ， compared with the sham group， 24hUPQ、α1-MG、β2-MG of model group were significantly raised（P<0.01）. These indicators of 3 treated groups rats were significantly reduced （P<0.01）. Compared with the control group，the above contents of 2 groups of QJC were obviously decreased （P<0.05-0.01），and dose-dependent manner. BS、Scr、Cystatin-C of the model group were also significantly raised（P<0.01）at same time.To compared with the control group，these indicators of 2 groups of QJC were obviously decreased （P<0.05-0.01）， BS of the control group was shown no significant change（P>0.05）. To compared with the control group，AngⅡ、ET-1 of 3 treated groups rats were significantly reduced（P<0.01）， NO were significantly raised（P<0.01）. HE staining showed that renal pathological damage were lessened by QJC. PAS stain showed that GSI、IF were significantly lessened in 2 traditional Chinese medicine treatment groups（P<0.01）.Electron microscopy observations show that thickening of glomerular basement membrane and mesangium hyperplasia were reduced by QJC， podocyte foot process fusion reduced. Immunohistochemical tests show that the expression of renal tissueTGF-β1 were down-regulated by QJC（P<0.01）. Conclusion Through secretion of AngⅡ was suppressed， vascular endothelial damage reduced，the expression of TGF-β1 in the renal tissues were down-regulated， structure and function of kidney tissues improved， DN is treated by QJC.

[Key words] Diabetic nephropathies； Qizhi Jiangtang Capsule； Transforming growth factor -β1；Vascular lesions

糖尿病腎?。―N）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的首位[1]及嚴重并發(fā)癥之一，也是導致慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）的常見病因。臨床研究表明[2-3]，芪蛭降糖膠囊不僅能明顯降低DNⅢ期患者的尿mALB及mALB/Ucr，也能降低Ⅳ期患者的大量蛋白尿，穩(wěn)定腎功能。實驗研究表明[4-6]，芪蛭降糖膠囊能夠通過下調(diào)腎組織中單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、MCP-1 mRNA的表達，降低大鼠腎實質小動脈內(nèi)膜/中膜厚度比，還能夠通過抑制DN大鼠腎組織中VEGF的過度合成和沉積、減輕ECM在腎組織中的積聚，從而減輕DN大鼠腎組織和血管結構病理損害；通過干預BMP-7/Smads/TGF-β1信號轉導通路抑制了TGF-β1信號的細胞內(nèi)轉導，對DN大鼠腎間質纖維化起到治療作用。其發(fā)病機制涉及遺傳、糖代謝紊亂、炎癥介質、細胞因子、血流動力學改變等多種因素環(huán)節(jié)。為進一步探討芪蛭降糖膠囊治療DN的的作用機理，本研究用右腎切除加腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）的方法制備大鼠DN模型，用芪蛭降糖膠囊治療，以纈沙坦為對照，觀察芪蛭降糖膠囊對DN大鼠腎臟結構和功能的影響，共觀察12周。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

清潔級雄性Wistar大鼠48只，6～7周齡，體重（180±20）g，購于山東中醫(yī)藥大學動物實驗中心。STZ（美國Sigma）、TGF-β1兔抗大鼠一抗多克隆抗體，通用型免疫組化試劑盒二抗，武漢博士德公司生產(chǎn)。芪蛭降糖膠囊，主要成分黃芪、水蛭、地黃、黃精，（吉林一正藥業(yè)集團有限公司，Z10950116）。纈沙坦膠囊（代文），（北京諾華制藥有限公司，H20040217）。

1.2 DN模型建立與分組

適應性飼養(yǎng)1周后，將48只Wistar大鼠按體重隨機取40只，采用右腎切除加腹腔注射STZ60mg/kg（STZ溶于10mmol/L檸檬酸緩沖液，pH4.5，按照6mL/kg注射）的方法建立DN模型。DN大鼠造模成功條件為：空腹血糖≥13.9mmol/L， 24h尿蛋白定量（24 huors urine protein quantitative，24hUPQ）≥30mg。按照24hUPQ高低排序，兩頭抽取隨機分為模型組、纈沙坦組（簡稱對照組）、芪蛭降糖膠囊低劑量組（簡稱低劑量組）、芪蛭降糖膠囊高劑量組（簡稱高劑量組）。另取8只正常大鼠行右腎假切除術，腹腔注射等量檸檬酸緩沖液作為假手術組。假手術組除不切除右腎外，余步驟與模型組相同。

1.3 給藥

成模2d后按《實驗動物學》根據(jù)大鼠體表面積計算給藥量。假手術組、模型組給予生理鹽水3mL灌胃，對照組給予纈沙坦28.8mg/（kg·d）（相當于成人用量的4倍）灌胃，低劑量組給予芪蛭降糖膠囊1.35g/（kg·d）（相當于成人用量的2倍）灌胃、高劑量組給予芪蛭降糖膠囊4.05g/（kg·d）（相當于成人用量的6倍）灌胃。將藥物分別去其外包裝，用生理鹽水3mL稀釋，所有大鼠在實驗期間均自由攝食飲水，不使用胰島素和其他降糖藥。

1.4 觀察指標和標本的采集與制備

實驗觀察12周（即實驗結束）時，將DN大鼠進行尿液檢查、血液檢查、腎組織的采集與病理觀察。

1.4.1 尿液檢測 將大鼠放入單只代謝籠，禁食，給予充足飲水，收集24h尿液，測定24UPQ，并檢測尿α1-MG、β2-MG。

1.4.2 血液檢測 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，下腔靜脈取血3mL，分離血清，由生化室測定BS、Scr、Cystatin-C，核醫(yī)學科用放免法嚴格按照試劑盒說明書操作測定AngⅡ、ET-1、NO。

1.4.3 腎組織檢查 麻醉取血后，快速切取左側腎臟，剝離包膜，沿縱軸切開，一側液氮凍存，用于免疫組化分析；另一側以10%福爾馬林固定24h后，用70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，每一組織蠟塊連續(xù)4μm切片六張，HE染色行常規(guī)光學顯微鏡觀察、拍照，PAS染色觀察腎小球和小管間質病理變化，分別采用Caij等半定量方法評估腎小球硬化指數(shù)（GSI）和間質纖維化指數(shù)（IF），半定量分析評估腎小球和小管間質病理改變。另取部分皮質固定，Epon812包埋，切片沿軸雙重染色后，透射電鏡觀察。

1.4.4 免疫組化染色 采用免疫組化法檢測TGF-β1的表達。用Qwin550CW型圖像信號采集與分析系統(tǒng)進行灰度值測量。高倍鏡下（400倍）每張切片分別取2個視野，每個視野面積約為0.1mm2。測量時每個視野隨機測量4個隨機面積內(nèi)陽性染色的灰度值。每個觀察指標在同一樣本中制作2張切片。免疫組化結果判斷：出現(xiàn)黃褐色反應為陽性，相同部位不出現(xiàn)黃色反應為陰性。根據(jù)顯色強度和陽性細胞數(shù)兩項指標判斷陽性等級。按顯色強度分為：無色、黃色、淺黃色、黃褐色。觀察各指標是否胞漿表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

各組數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進行處理，以（）表示，組間比較采用方差齊性檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

因麻醉過度，死亡1只大鼠，灌胃期間，模型組死亡1只，余大鼠均無死亡。實驗期間模型組大鼠皮毛蓬松，暗淡無光，精神萎靡，活動遲緩，食量減少，體重減輕。其余3個治療組大鼠皮毛、精神、活動及飲食均好于模型組，高劑量組大鼠各方面情況接近假手術組大鼠。

2.2 各組大鼠尿液24hUPQ、α1-MG和β2-MG的比較

實驗12周時，模型組大鼠24hUPQ、α1-MG和β2-MG均較假手術組顯著升高（P<0.01），對照組、低劑量組、高劑量組均低于模型組（P<0.01），而且三組依次降低，組間比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠BS、Scr、Cystatin-C的比較

在實驗12周末，模型組大鼠BS、Scr、Cystatin-C均較假手術組顯著升高（P<0.01），對照組Scr較模型組顯著降低（P<0.01），而BS、Scr、Cystatin-C較模型組降低不明顯（P>0.05），低劑量組、高劑量組均顯著低于模型組（P<0.01），高劑量組與低劑量組比較也有差異（P<0.05）。見表1。

2.4 各組大鼠血漿AngⅡ、ET-1、NO的比較

實驗終止時，模型組AngⅡ、ET-1顯著高于假手術組、NO顯著低于假手術組（P<0.01）。3個治療組和模型組相比，AngⅡ、ET-1顯著降低，NO顯著升高（P<0.01）。和對照組相比，低劑量組AngⅡ明顯偏高（P<0.05），ET-1、NO無顯著差異（P>0.05）；和低劑量組相比，高劑量組AngⅡ、ET-1明顯降低（P<0.05）。見表2。

2.5 各組大鼠腎臟組織學改變

2.5.1 HE染色 假手術組腎組織結構正常，模型組大鼠與假手術組相比，腎小球肥大，部分腎小球萎縮，GBM彌漫增厚，毛細血管擴張，系膜基質增生明顯，腎小管管腔擴張明顯，上皮細胞排列紊亂，并有壞死脫落，球囊粘連現(xiàn)象較明顯，纖維化程度高。對照組和低劑量組病變有所減輕，高劑量組腎小球肥大明顯減輕，部分系膜基質增生、基底膜增厚，但程度明顯減輕，部分腎小管擴張，腎小管修復現(xiàn)象明顯。見圖1。

2.5.2 PAS染色 模型組大鼠腎小球毛細血管腔狹

2.5.3 電鏡 假手術組大鼠腎組織結構清晰，無明顯病理改變。模型組GBM均質性增厚，外疏松層、致密層和內(nèi)疏松層分層錯雜，系膜基質增多明顯，系膜細胞增生積聚處可見小結節(jié)團塊狀，內(nèi)皮細胞之間窗孔間隙變大，內(nèi)皮細胞增生顯著，足細胞足突廣泛融合，腎小囊可見玻璃滴狀病變。對照組和低劑量組病變較模型組輕，高劑量組GBM略增厚，三層濾過膜分布清晰，系膜基質輕度增生，內(nèi)皮細胞之間窗孔間隙未見明顯擴大，足細胞足突融合不明顯，腎小囊無玻璃滴狀病變。見圖3。

2.5.4 各組大鼠腎組織TGF-β1的表達 假手術組著色最淺，說明TGF-β1蛋白表達極少。DN模型組大鼠腎組織TGF-β1蛋白呈強陽性表達，表現(xiàn)為黃褐色顆粒狀沉積，著色較深，較假手術組明顯增強，兩組間的灰度值具有顯著性差異（P<0.01）。對照組、低劑量組、高劑量組大鼠腎組織的著色逐漸變淺，TGF-β1表達逐漸減弱，各治療組與模型組間灰度值差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），低劑量組與對照組間、高劑量組與低劑量組間灰度值有明顯差異（P<0.05）。見圖4、表2。

3 討論

糖尿病發(fā)病機制中，AngⅡ可以通過血流動力學和非血流動力學產(chǎn)生雙重作用[7]，經(jīng)過多種途徑誘導腎小球GBM中Ⅳ型膠原蛋白合成。動物試驗已證實尿蛋白水平與腎臟進行性損傷的進展速度呈正相關，這種損傷表現(xiàn)為巨噬細胞浸潤和細胞外基質的沉積，最終可導致腎小球的硬化[8]。AngⅡ還可通過非血流動力學效應直接介導腎臟細胞增生以及誘導細胞合成分泌TGF、腫瘤壞死因子、血小板源性生長因子、ET、白細胞介素[9]和血小板活化因子。這些細胞因子在DN中的作用涉及腎小球血流動力學改變、細胞外基質代謝、細胞增生和細胞肥大等。有研究[10]表明高糖誘導培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞Ang-Ⅱ表達上調(diào)，Ya-mamoto等[11]也發(fā)現(xiàn)2～3周的STZ糖尿病小鼠腎臟Ang-Ⅱ蛋白表達上調(diào)，這與我們的實驗結果相一致，提示在糖尿病腎臟存在Ang-Ⅱ異常表達，AngⅡ導致TGF-β1表達明顯增加，刺激氧自由基及細胞因子的釋放，抑制細胞增殖，介導細胞凋亡[12]。TGF-β1直接和間接的上皮-間充質轉分化（EMT）作用可使上皮細胞轉化為成纖維細胞表型，從而具有了產(chǎn)生ECM的能力，參與了腎纖維化過程。通過干預DN狀態(tài)下的TGF-β1升高，阻斷其信號轉導可抑制腎臟纖維化[13]。

血管內(nèi)皮細胞功能損傷是DN發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎。血管內(nèi)皮損傷表現(xiàn)為血管收縮與舒張功能失調(diào)。NO是內(nèi)皮細胞釋放的有效的血管擴張劑，在保持血管穩(wěn)態(tài)上起關鍵作用。NO可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞分泌合成ET的生理作用，ET除作用于血管平滑肌細胞膜上的ETA受體引起血管收縮外，同時還作用于血管內(nèi)皮細胞上的ETB受體，刺激NOS增加NO的合成，從而負反饋地抑制ET收縮腎臟血管的作用。NO的釋放減少或活性降低可能是血管功能障礙和動脈粥樣硬化形成的原因之一[14]。ET-1是唯一被認為系內(nèi)皮細胞基礎分泌的內(nèi)皮素，也是目前已知作用最強和持久的縮血管物質[15]。DN早期，ET-1表達下調(diào)參與了腎小球高濾過和高灌注的形成[16]。隨著DN的進展，糖基化終末產(chǎn)物、TGF-β1等增加則促進了ET-1的增加，加速DN進展[17]。腎臟既是ET合成代謝的重要場所，又是其主要的靶器官，因此血漿ET水平可反映腎臟受損的嚴重程度。

芪蛭降糖膠囊具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡的功效。中醫(yī)對于消渴、水腫的研究也有著豐富的經(jīng)驗，然而有效的中成藥在臨床中很少被證實，DNⅢ期和Ⅳ期以氣陰兩虛、瘀血阻絡為基本病機，而芪蛭降糖膠囊正是針對此病機而組方，黃芪補氣健脾，利尿消腫，水蛭逐瘀消徵，黃精與黃芪配伍，加強黃芪補氣養(yǎng)陰的作用，同時能補益腎精，生地黃既能清熱養(yǎng)陰，又能生津止渴，標本同治。本研究用右腎切除加腹腔注射STZ的方法復制DN大鼠動物模型，芪蛭降糖膠囊治療后，DN大鼠血漿AngⅡ分泌明顯減少，ET-1、NO改善，腎組織TGF-β1表達顯著下調(diào)，GSI、IF顯著下降，腎功能穩(wěn)定，尿24hUPQ、α1-MG和β2-MG排泄減少，表明芪蛭降糖膠囊通過抑制AngⅡ分泌、保護血管內(nèi)皮細胞、下調(diào)腎臟組織TGF-β1表達，而起到治療DN的作用。

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（收稿日期：2014-10-15）