孟慶玲，張?jiān)俪?，?軍

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003）

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes，LM）是一種能引起人和動(dòng)物李氏桿菌病的人獸共患病原菌[1]。作為一種重要的食源性細(xì)菌，該菌能污染肉、奶、蛋等動(dòng)物性食品而引起食品中毒，導(dǎo)致孕婦、新生兒及免疫力低下的成年人發(fā)病，對(duì)人們的身體健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，被列為四大食源性病原菌之一[2-3]。病原學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)很多城市動(dòng)物性食品中都存在LM的污染，動(dòng)物性食品已經(jīng)成為人感染LM的主要傳播媒介。為了解新疆石河子地區(qū)動(dòng)物性中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染狀況，我們對(duì)石河子地區(qū)5個(gè)具有代表性動(dòng)物性食品零售點(diǎn)的8類(lèi)動(dòng)物性食品進(jìn)行病原的分離培養(yǎng)和PCR檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物性食品檢測(cè)樣品的采集

選擇石河子5個(gè)具有代表性的動(dòng)物性食品零售點(diǎn)，于2009年10—12月隨機(jī)采集生鮮豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、凍雞肉、凍蝦和凍帶魚(yú)8類(lèi)動(dòng)物性食品共249份。

1.2 主要試劑

細(xì)菌分離鑒定試劑：LB1、LB2增菌液、TSA-YE、SIM動(dòng)力培養(yǎng)基、TSI和其他鑒定用的生化培養(yǎng)基均購(gòu)自上海生物工程有限公司。生化鑒定試條API Listeria購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。PCR檢測(cè)用試劑：Taq plus DNA聚合酶、dNTPs和細(xì)菌DNA 提取試劑盒均購(gòu)自上海生物工程公司。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及鑒定

細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定參照GB4789.30-2003進(jìn)行。以無(wú)菌操作將25 g樣品加入到225 mL LB1增菌液中，30℃培養(yǎng)24 h。取0.1 mL加入到10 mL LB2增菌液中30℃培養(yǎng)24 h。無(wú)菌取LB2增菌液轉(zhuǎn)種到CHRO Magar李斯特菌顯色培養(yǎng)基瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)24 h。菌落特征為中心綠色，周?chē)鷰О咨珪炄Α？梢删渫瑫r(shí)接種于SIM和TSI培養(yǎng)基中，SIM培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)5 d，TSI培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h。LM動(dòng)力呈傘狀或月牙狀生長(zhǎng)，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。將以上可疑菌落接種于TSA-YE瓊脂培養(yǎng)基中，37℃24 h的純培養(yǎng)。

將TSA-YE培養(yǎng)基內(nèi)的單個(gè)菌落做革蘭氏染色鏡檢，做氧化酶、觸酶試驗(yàn)，并接種鼠李糖、木糖、甘露醇、七葉苷，同時(shí)點(diǎn)種血平板觀察溶血情況，用標(biāo)準(zhǔn)菌株作對(duì)照，凡染色鏡檢和生化與LM相吻合者，再用API Listeria鑒定試劑條進(jìn)行鑒定。

1.4 PCR檢測(cè)

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的LM PrfA蛋白基因序列，選擇高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)了特異的引物P1和P2，上游引物 P1：5'-GCTCACGAGTATTAGC GAGA-3'；下游引物 P2：5'-GATAA TCAAGATTTTGTACA-3'。擴(kuò)增預(yù)期長(zhǎng)度為475 bp。用SDS-蛋白酶K法提取樣品DNA。取提取的DNA為模板 2μL，10×PCR buffer5μL、引物P1（25 pmol/μL）、P2（25 pmol/μL）各 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs各 4 μL，水36.7μL，Taq DNA聚合酶0.3μL（5 U/μL）混勻。PCR 反應(yīng)條件為 96℃預(yù)變性 180 s；94 ℃，40 s；56℃，35 s；72℃，45 s，35 個(gè)循環(huán)；然后72℃再延伸10 min，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。回收PCR產(chǎn)物，送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與PrfA蛋白基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 石河子地區(qū)8類(lèi)動(dòng)物性食品LM細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

8類(lèi)食品中，成功分離出16株細(xì)菌，其中12株生化試驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC54007相一致，均為溶血反應(yīng)陽(yáng)性，硝酸鹽還原陰性，尿素酶陰性，MR陽(yáng)性，VP陽(yáng)性，甘露醇陰性，鼠李糖陽(yáng)性，木糖陰性，七葉苷陽(yáng)性，用API-Listeria系統(tǒng)鑒定為陽(yáng)性。LM分離培養(yǎng)陽(yáng)性率最高為凍雞肉和凍蝦，分別為12.82%和7.14%，表明其污染最為嚴(yán)重；其次為生鮮雞肉和凍帶魚(yú)，陽(yáng)性率分別為5.26%和4.82%；生鮮牛肉和羊肉均未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（表1）。

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2.2 PCR檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用PCR法對(duì)8類(lèi)食品249份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)出陽(yáng)性樣品36份，平均陽(yáng)性率為14.46%。其中，凍蝦和凍雞肉PCR陽(yáng)性率仍然最高，分別為35.71%和28.21%；其次為生鮮雞肉和凍帶魚(yú)，陽(yáng)性率分別為15.79%和 13.04%（表 1、圖 1）。

3 討論

LM屬于革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽孢兼性厭氧桿菌，在酸性（pH 4.5~7.0）、堿性（pH 7.0~9.0）、高鹽（10%NaCl）、低溫（0~4℃）等條件下能生長(zhǎng)繁殖。由于其對(duì)外界各種環(huán)境的抵抗力很強(qiáng)，并且可通過(guò)多種途徑發(fā)生播散，造成多種動(dòng)物性食品的污染。自從20世紀(jì)90年代以來(lái)，世界許多國(guó)家暴發(fā)了LM污染食物引起的中毒事件，美國(guó)、加拿大、法國(guó)等國(guó)家加強(qiáng)了對(duì)動(dòng)物性食品中的LM的檢測(cè)[2-3]，我國(guó)在2000年建立了全國(guó)食源性疾病檢測(cè)網(wǎng)，開(kāi)始對(duì)食品中LM污染進(jìn)行了檢測(cè)。Vitas等對(duì)西班牙的295份生肉制品檢測(cè)單增李斯特菌的污染率為34.9%，158份生家禽制品的污染率為36.1%[4]。丹麥的Birgit等對(duì)3 629份生肉制品檢出單增李斯特菌的污染率為9.6%，225份冷藏肉制品中單增李斯特菌的污染率為14.7%[9]。我國(guó)河南、江蘇、山東、陜西等地對(duì)肉類(lèi)的單增李斯特菌的調(diào)查顯示，生肉制品的污染率為3.15%~16.68%[5-8]。在本試驗(yàn)中，我們檢測(cè)的8類(lèi)249份動(dòng)物性食品，LM分離成功的陽(yáng)性樣品12份，平均陽(yáng)性率4.82%；PCR法檢測(cè)陽(yáng)性樣品36份，平均陽(yáng)性率為14.46%，這表明石河子動(dòng)物性食品中LM的污染比較普遍，尤以凍雞肉和凍蝦LM污染較重。

目前，傳統(tǒng)的LM分離鑒定如國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中EB增菌法和LB增菌法，即通過(guò)微生物的分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)、溶血試驗(yàn)、協(xié)同溶血試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)等，這些試驗(yàn)方法雖然設(shè)備要求不高，可操作性強(qiáng)，但其缺點(diǎn)是檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，一般需6~7 d。由于動(dòng)物性食品需要現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和消費(fèi)前的快速檢測(cè)，而這種傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已很難滿足動(dòng)物性食品的快速檢測(cè)要求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)等新的方法在LM快速檢測(cè)研究中得到了初步應(yīng)用。在本試驗(yàn)中，我們根據(jù)LM P60蛋白基因具有高度保守性的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了其特異性引物用于LM的PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，該方法具有快速、敏感和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可以作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的輔助檢測(cè)方法，適合具備一定儀器設(shè)備檢測(cè)部門(mén)用于LM的快速檢測(cè)。

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