馬立軍， 陳麗平， 劉家熔， 龔 軍， 楊麗庭

(華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東廣州 510006)

谷氨酸修飾的汞離子熒光探針的合成及性能研究

馬立軍， 陳麗平， 劉家熔， 龔 軍， 楊麗庭*

(華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東廣州 510006)

該文報(bào)道了2種熒光探針分子(丹酰谷氨酸(DEA)和丹酰谷氨酸二甲酯(DE))，在它們的水溶液中加入牛血清白蛋白(BSA)，熒光探針分子的熒光發(fā)射增強(qiáng).在水溶液中,DEA/BSA和DE/BSA的復(fù)合體系都可以對(duì)Hg2+產(chǎn)生有效的識(shí)別，識(shí)別信號(hào)來自于復(fù)合體系熒光發(fā)射峰的藍(lán)移以及熒光強(qiáng)度的變化.

汞離子; 熒光探針; 谷氨酸

汞是重金屬中毒害最大的元素，它一旦進(jìn)入生物體，極易與生物體內(nèi)蛋白質(zhì)分子中的巰基(-SH)結(jié)合形成巰醇鹽，在體內(nèi)某些組織中累積、富集后造成慢性中毒，引起以神經(jīng)損害為主的多種疾病[1-2]．因此，在生命、環(huán)境和醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域中汞離子的檢測(cè)具有非常重要的意義．利用傳統(tǒng)的方法，如原子吸收光譜和等離子體發(fā)射光譜(ICP)、電化學(xué)和氣相色譜等方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的檢測(cè)[3-5]，它們的特點(diǎn)在于測(cè)定準(zhǔn)確、干擾少、測(cè)量范圍廣并適用于環(huán)境水樣的定量分析，但一般需要多步復(fù)雜的樣品準(zhǔn)備以及尖端的實(shí)驗(yàn)儀器，所以分析成本比較昂貴．也可以利用一些新興的方法來檢測(cè)Hg2+，如生物和納米傳感器、小分子比色探針以及熒光探針等傳感器類來檢測(cè)Hg2+，這些方法能較好地適用于快速、實(shí)時(shí)、原位定量檢測(cè)和分析[6-8].近年來，熒光探針發(fā)展迅速，這主要由于它在溶液中容易使用，同時(shí)對(duì)痕量金屬離子具有很高的選擇性和靈敏度，因此很容易應(yīng)用到重金屬離子的檢測(cè)[9-10]．另外，實(shí)現(xiàn)水溶液中Hg2+的檢測(cè)才更具有實(shí)際意義，因此就要求熒光探針具有較好的水溶性．基于此，本文引入水溶性優(yōu)異的氨基酸-谷氨酸作為金屬離子的識(shí)別基團(tuán)，設(shè)計(jì)、合成了2種氨基酸的衍生物-丹酰谷氨酸二甲酯和丹酰谷氨酸，期望通過含2個(gè)羧基的谷氨酸與熒光團(tuán)-丹?；鶊F(tuán)的結(jié)合，來實(shí)現(xiàn)在水溶液中識(shí)別重金屬離子，特別是識(shí)別汞離子.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

本實(shí)驗(yàn)核磁測(cè)試采用美國(guó)Varian公司的Varian NMR Systems 400MHz核磁共振波譜儀；質(zhì)譜采用美國(guó)熱電集團(tuán)菲尼根質(zhì)譜公司的LCQ Deca XP MAX液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；熒光光譜測(cè)試采用日本日立FL-2500熒光光譜儀，本論文溶液樣品所采用的激發(fā)波長(zhǎng)均為340 nm；丹酰氯購(gòu)于Alfa Aesar公司；谷氨酸和牛血清白蛋白購(gòu)于百靈威公司；其它試劑為市售分析純；金屬離子均為氯化物形式.

1.2熒光探針分子的合成與表征

丹酰谷氨酸二甲酯(簡(jiǎn)稱DE)和丹酰谷氨酸(簡(jiǎn)稱DEA)的合成步驟如圖1所示．

5.0 mL無水甲醇置于冰鹽浴下冷卻后，滴加0.70 mL氯化亞砜，再加入1.0 g谷氨酸，混合體系室溫下攪拌2 h．然后將反應(yīng)體系放入70～80 ℃水浴中回流30 min，之后蒸去大部分甲醇．再加入40 mL無水乙醚，有白色沉淀產(chǎn)生，體系在0 ℃下冷卻2 h后過濾出沉淀，干燥后得到谷氨酸二甲酯鹽酸鹽1.1 g，產(chǎn)率77%[11]．

0.30 g谷氨酸二甲酯鹽酸鹽與0.28 g碳酸氫鈉在水中反應(yīng)15 min后，用氯仿萃取多次，得到淡黃色油狀物谷氨酸二甲酯0.15 g，產(chǎn)率為63%．

圖1 熒光探針分子的合成路線Fig.1 Synthesis route of fluorescent probes DE and DEA

0.20 g丹酰氯溶于少量無水丙酮中，冰鹽浴下將其滴加到含0.11 g谷氨酸二甲酯和0.20 mL三乙胺的無水丙酮中，攪拌0.5 h后置于室溫下繼續(xù)反應(yīng)12 h．反應(yīng)完畢后蒸去丙酮，將得所固體粗產(chǎn)物溶于氯仿中，用飽和碳酸氫鈉溶液洗至弱堿性，再用稀鹽酸洗至弱酸性，最后用水洗至中性．經(jīng)無水硫酸鎂干燥后，蒸干氯仿得到的粗產(chǎn)物，用氯仿做展開劑進(jìn)行硅膠柱層析分離，得到0.14 g黃色固體丹酰谷氨酸二甲酯，產(chǎn)率48%[12]．1H-NMR 譜(400 MHz，CDCl3)：8.580～7.209(m，6H)，5.452(d，1H)，3.927(m，1H)，3.589(s，3H)，3.272(s，3H)，2.900(s，6H)，2.299(m，2H)，2.044～1.778(m，2H).ESI-MS: 409.1.

將0.10 g丹酰谷氨酸二甲酯溶于40 mL 1 M的NaOH溶液中，室溫?cái)嚢?.5 h后基本溶解.用乙酸乙酯洗滌4次，除去沒有完全反應(yīng)的原料和副產(chǎn)物.水相中加入鹽酸至弱酸性，再用乙酸乙酯萃取至水溶液中無熒光，此有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥.最后得到0.037 g黃色固體粉末丹酰谷氨酸，產(chǎn)率40%.1H-NMR 譜(400 MHz，DMSO-d6)：12.181(s,2H),8.418～7.195(m，6H)，3.685(m，1H)，2.788(s，6H)，1.984(m，2H)，1.798～1.535(m，2H).ESI-MS:379.1.

1.3實(shí)驗(yàn)測(cè)試溶液的配置

將丹酰谷氨酸二甲酯(DE)和丹酰谷氨酸(DEA)溶于DMSO中，分別配置成濃度為0.020 M的儲(chǔ)備溶液. 取儲(chǔ)備液分別配置成濃度為20.0 μM的含DMSO為2%(體積分?jǐn)?shù))的水溶液；分別配置1.0 mM的牛血清白蛋白(簡(jiǎn)稱BSA)和5.0 mM的HgCl2、CdCl2、PbCl2、CrCl3、CuCl2、CoCl2、AlCl3的水溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1熒光探針與BSA相互作用的熒光光譜研究

在丹酰谷氨酸(DEA)和丹酰谷氨酸二甲酯(DE)的水溶液(20.0 μM)中分別加入不同濃度的BSA．如圖2所示，隨著不同濃度BSA的加入，DEA和DE的熒光發(fā)射峰發(fā)生明顯的藍(lán)移，DEA發(fā)射峰最大藍(lán)移44 nm，而DE最大藍(lán)移為33 nm；同時(shí)2個(gè)熒光發(fā)射峰都伴隨著熒光強(qiáng)度的增加．這樣的現(xiàn)象主要由于DEA、DE在與BSA作用時(shí)，其丹?；鶊F(tuán)由水相轉(zhuǎn)移到了蛋白質(zhì)的疏水空腔中，從而屏蔽了氧氣、溶劑分子以及其它因素引起的猝滅，使丹?；鶊F(tuán)在結(jié)合蛋白質(zhì)之后熒光量子產(chǎn)率得到明顯的增加．同時(shí)，化學(xué)微環(huán)境的明顯改變導(dǎo)致熒光發(fā)射峰產(chǎn)生了藍(lán)移[13].這些結(jié)果反映出DEA、DE與BSA的結(jié)合表現(xiàn)出非常明顯的光譜特征變化.

2.2DEA/BSA復(fù)合體系對(duì)Hg2+的識(shí)別

在DEA/BSA(摩爾比為1∶1)的復(fù)合體系中分別加入Hg2+、Cd2+、Pb2+、Cr3+、Cu2+、Co2+和Al3+.研究發(fā)現(xiàn)，不同的金屬離子所引起的光譜變化明顯不同，如圖3所示. Cu2+的加入會(huì)引起DEA/BSA復(fù)合體系熒光強(qiáng)度的明顯下降，Cr3+、Co2+的影響類似，這可能由于這些重金屬離子具有較強(qiáng)的猝滅能力所致．Cd2+的加入對(duì)DEA/BSA體系熒光發(fā)射性質(zhì)幾乎沒有影響，說明這類離子對(duì)DEA與BSA的相互作用影響很小或者沒有影響．而Hg2+的加入會(huì)引起DEA/BSA復(fù)合體系熒光強(qiáng)度先增強(qiáng)后下降，并伴隨熒光發(fā)射峰的藍(lán)移(△max=17 nm)．另外，Pb2+的加入會(huì)引起復(fù)合體系熒光強(qiáng)度的增加，Al3+的影響類似．

圖2 丹酰谷氨酸(a)和丹酰谷氨酸二甲酯(b)(20.0 μM)中加入不同濃度BSA的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of (a) DEA and (b) DE (20.0 μM) with different concentrations of BSA

圖3 DEA/BSA(摩爾比為1∶1)復(fù)合體系中分別加入(a)Cu2+、(b)Cd2+、(c)Hg2+、(d)Pb2+的熒光光譜

Fig.3 Fluorescence spectra of DEA/BSA (mol/mol=1∶1) with different concentrations of (a) Cu2+, (b) Cd2+, (c) Hg2+, (d) Pb2+

通過比較這7種金屬離子對(duì)DEA/BSA復(fù)合體系熒光光譜的影響可以明顯看出，DEA/BSA復(fù)合體系對(duì)Hg2+表現(xiàn)出特異性識(shí)別，這種識(shí)別以熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度變化(先增加后減小)以及峰位的藍(lán)移為響應(yīng)信號(hào)．DEA由水相進(jìn)入到BSA的疏水空腔后，由于丹?；鶊F(tuán)微環(huán)境極性的變化導(dǎo)致它的熒光發(fā)生藍(lán)移并伴隨熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)(如圖2(a)所示).而隨后Hg2+的加入進(jìn)一步促進(jìn)了DEA熒光發(fā)射峰的藍(lán)移，這說明Hg2+很可能誘導(dǎo)丹?；鶊F(tuán)進(jìn)入更為疏水的環(huán)境. 參照文獻(xiàn)[14-15]，丹磺酰胺類化合物中，磺酰胺基團(tuán)的氨基容易發(fā)生去質(zhì)子化，并在去質(zhì)子化后極易與金屬離子結(jié)合.因此, 丹?；鶊F(tuán)與BSA結(jié)合時(shí)，磺酰胺基團(tuán)的氨基與蛋白質(zhì)分子中的氨基酸殘基產(chǎn)生氫鍵作用容易使其發(fā)生質(zhì)子化，導(dǎo)致Hg2+與磺?；鶊F(tuán)的氨基發(fā)生作用后使得整個(gè)丹?；鶊F(tuán)進(jìn)入BSA空腔更為疏水的部分，促使其熒光發(fā)射峰發(fā)生藍(lán)移和熒光強(qiáng)度的變化，從而產(chǎn)生識(shí)別Hg2+的光譜特征. 對(duì)于機(jī)理的進(jìn)一步分析也正在開展中.

另外，Pb2+和Al3+的加入也能夠引起DEA/BSA復(fù)合體系熒光增強(qiáng)，也具有一定程度的識(shí)別效果，但是它們沒有發(fā)生Hg2+那樣的熒光峰藍(lán)移，這顯示了Pb2+和Al3+對(duì)DEA與BSA的結(jié)合產(chǎn)生了一定的影響，但效果不如Hg2+．以DEA最大發(fā)射波長(zhǎng)在金屬離子加入前后熒光峰位移的大小作為考察對(duì)象，來展示DEA/BSA復(fù)合體系對(duì)Hg2+所表現(xiàn)的特異選擇性. 將7種不同的金屬離子對(duì)DEA/BSA復(fù)合體系熒光性質(zhì)的影響整理如圖4所示．

圖4 不同濃度金屬離子的加入引起DEA/BSA(摩爾比為1∶1)復(fù)合體系熒光發(fā)射峰的位移

Fig.4 Fluorescence peak shift of DEA/BSA (mol/mol=1∶1) with different concentrations of metal ions

2.3DE/BSA復(fù)合體系對(duì)Hg2+的識(shí)別

對(duì)DE/BSA復(fù)合體系做相同的研究，結(jié)果顯示，DE/BSA(摩爾比為1∶1)復(fù)合體系對(duì)Hg2+同樣表現(xiàn)出選擇性識(shí)別，Hg2+的加入引起體系熒光峰的藍(lán)移(△max=17 nm)并伴隨著熒光強(qiáng)度的下降(如圖5所示)，但在低濃度時(shí)它的識(shí)別效果不如DEA/BSA復(fù)合體系．這可能是由于DEA、DE與BSA的相互作用存在差別(如圖2)所致．而其它金屬離子對(duì)DE/BSA復(fù)合體系熒光強(qiáng)度的影響也僅是不同程度的熒光猝滅，或者沒有影響，類似于圖3中的Cu2+或Cd2+．

圖5 DE/BSA(摩爾比為1∶1)體系中加入Hg2+的熒光光譜

Fig.5 Fluorescence spectra of DE/BSA (mol/mol = 1:1) with different concentrations of Hg2+

3 結(jié)論

以高水溶性的谷氨酸作為金屬離子的識(shí)別基團(tuán)，將其與丹酰熒光基團(tuán)化合得到2種水溶性較好的熒光探針分子-丹酰谷氨酸二甲酯(DE)和丹酰谷氨酸(DEA)．通過熒光光譜的測(cè)試發(fā)現(xiàn)，DEA/BSA和DE/BSA的復(fù)合體系都可以對(duì)Hg2+產(chǎn)生識(shí)別性結(jié)合，識(shí)別信號(hào)來自于復(fù)合體系熒光發(fā)射峰的藍(lán)移以及熒光強(qiáng)度的變化. DEA/BSA和DE/BSA的復(fù)合體系在水溶液中對(duì)Hg2+的選擇性識(shí)別效應(yīng)為水介質(zhì)中Hg2+的檢測(cè)提供了一個(gè)可能的有效途徑.

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Keywords： mercury ion; fluorescence probes; glutamic acid

【責(zé)任編輯 成 文】

THESYNTHESISANDMECHANISMSTUDYOFGLUTAMICACID-BASEDFLUORESCENTPROBESFORMERCURYION

MA Lijun, CHEN Liping, LIU Jiarong, GONG Jun, YANG Liting*

(School of Chemistry and Environment, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Two fluorescence probes are reported: dansyl-glutamic acid (DEA) and dimethyl-dansyl-glutamic acid (DE). The fluorescent emissions of fluorescence probes increase with the addition of bovine serum albumin (BSA) in the solutions of DEA and DE. The complexs of DEA/BSA and DE/BSA show specific selectivity for Hg2+in aqueous solution with blue-shift of fluorescence peak and intensity change.

2009-12-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20903041)

馬立軍(1981—),男,黑龍江人,博士,華南師范大學(xué)講師, 主要研究方向：重金屬離子熒光探針,Email: mlj898021@scnu.edu.cn;楊麗庭(1963—)，男，河北人，博士，華南師范大學(xué)教授，主要研究方向：高分子材料結(jié)構(gòu)與性能，Email: yanglt63@yahoo.com.cn.

*通訊作者

1000-5463(2010)02-0067-05

O629.71

A