秦金丹 周國雄 黃介飛 丁曉凌 張海峰 張弘

·論著·

5-LOX基因沉默對人胰腺癌細(xì)胞SW1990裸鼠移植瘤生長的影響

秦金丹 周國雄 黃介飛 丁曉凌 張海峰 張弘

目的觀察裸鼠的人胰腺癌細(xì)胞SW1990移植瘤內(nèi)注射靶向5-脂氧合酶(5-LOX)的短發(fā)夾RNA(shRNA)對移植瘤以及瘤組織5-LOX和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響，探討其臨床應(yīng)用價值。方法將胰腺癌細(xì)胞SW1990接種至裸鼠背部皮下，待移植瘤生長至100 mm3左右后隨機(jī)分為shRNA1組、shRNA2組、陰性對照shNC組和脂質(zhì)體組。每組6只，雌雄各半。實驗組瘤內(nèi)注射相應(yīng)shRNA 50 μg/次，1次/3 d，共7次。對照組瘤內(nèi)注射脂質(zhì)體液100 μ1/只。每3 d測體重及移植瘤長、短徑一次。第29天處死動物，取腫瘤組織，稱瘤重。應(yīng)用免疫組化和RT-PCR法檢測移植瘤組織5-LOX、VEGF的mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果shRNA1組、shRNA2組、shNC組和脂質(zhì)體組的瘤重分別為(32.5±19.0)mg、(30.1±14.1)mg、(50.5±15.6)mg和(71.7±25.4)mg，shRNA1組、shRNA2組、shNC組抑瘤率分別為54.7%、58.0%和29.5%，shRNA1組、shRNA2組較shNC組和脂質(zhì)體組相差顯著(P值均<0.05)。shRNA1組和shRNA2組移植瘤的5-LOX、VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)較shNC組和脂質(zhì)體組均顯著減少，但兩治療組之間未見明顯差異，shNC組和脂質(zhì)體組之間也無明顯差異。結(jié)論靶向5-LOX的RNA干擾治療通過直接抑制5-LOX的表達(dá)、間接抑制VEGF的表達(dá)而抑制SW1990裸鼠移植瘤的生長。

胰腺腫瘤； RNA干擾； 5-脂氧合酶； 血管內(nèi)皮生長因子

早期的流行病學(xué)調(diào)查顯示,高脂飲食尤其是不飽和脂肪的攝入與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)[1-2]。最近的研究證實,5-脂氧合酶(5-LOX)代謝途徑的異常是多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[3]。5-LOX抑制劑對胰腺癌細(xì)胞具有抑制作用[4]。RNA干擾(RNA interference, RNAi) 技術(shù)是近年來新興的一種可以快速、高效地促使體內(nèi)特定基因mRNA降解,實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄后沉默的方法[5]。我們先前的研究表明，靶向5-LOX的短發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞株SW1990可以特異地抑制細(xì)胞5-LOX的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[6]。本實驗通過體內(nèi)實驗觀察靶向5-LOX的shRNA治療胰腺癌移植瘤的效果，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、靶向5-LOX的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

由上海吉瑪公司構(gòu)建兩對針對5-LOX基因的shRNA及一對陰性對照shRNA(shNC)。ALOX5-1021(shRNA1)正義鏈5′-CACCGCTCCCATCTGCTT-GCTGTATTTCAAGAGAATACAGCAAGCAGATGGGA-GCTTTTTTG-3′，反義鏈5′-GATCCAAAAAAGCTCCCATCTGCTTGCTGTATTCTCTTGAAATACAGCAAG-CAGATGGGAGC-3′；ALOX5-315(shRNA2)正義鏈5′-CACCGCGCAAGTACTGGCTGAATGATTCAAGAG-ATCATTCAGCCAGTACTTGCGCTTTTTTG-3′，反義鏈5′-GATCCAAAAAAGCGCAAGTACTGGCTGAATGAT-CTCTTGAATCATTCAGCCAGTACTTGCGC-3′(1021、315是設(shè)計的shRNA的靶基因位點起始位置)；shNC正義鏈5′-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACAC GTTCGGAGAATTTTTTG-3′，反義鏈5′-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTG ACGTGACACGTTCGGAGAAC-3′。3組shRNA分別插入pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒。

二、胰腺癌移植瘤動物模型的建立及分組

人胰腺癌細(xì)胞SW1990(中分化)購自上?？蠌姽?。常規(guī)培養(yǎng)傳代。待細(xì)胞長至瓶底80%～90%，胰酶消化收集細(xì)胞，加入無血清DMEM培養(yǎng)基。錐蟲藍(lán)染色計數(shù)，活細(xì)胞比例>98%，則調(diào)整活細(xì)胞濃度為1×108個/ml，分裝于1 ml的無菌EP管中備用。

BALB/c nu/nu裸鼠購自中國人民解放軍南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)動物實驗中心。皮膚消毒后，于裸鼠右側(cè)腋下注射0.1 ml SW1990細(xì)胞懸液。待移植瘤長至約100 mm3時(11 d左右)分為shRNA1組、shRNA2組、shNC組和脂質(zhì)體組。每組6只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。實驗組瘤內(nèi)注射相應(yīng)shRNA 50 μg/次，1次/3 d，共7次。對照組瘤內(nèi)注射脂質(zhì)體液100 μl/只。每3 d用體重計測量體重一次，用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的長、短徑一次。第29天處死動物，取腫瘤組織，稱瘤重。

三、觀察指標(biāo)

1．腫瘤體積及抑瘤率：腫瘤體積V=1/2×ab2，a為腫瘤最大長徑，b為腫瘤短徑[7]。抑瘤率(%)=(1-實驗組瘤重/對照組瘤重)×100%。

2．移植瘤組織5-LOX、VEGF蛋白表達(dá)的檢測：采用免疫組化方法。腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為表達(dá)陽性細(xì)胞。評分標(biāo)準(zhǔn)：按染色強度，無色為0分，弱陽性為1分，中度陽性為2分，強陽性為3分；按陽性細(xì)胞百分率，無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞率≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。二者相乘得0為-，1～4分為+，5～8分為++，9～12分為+++。

3．移植瘤組織5-LOX、VEGF mRNA表達(dá)的檢測：采用RT-PCR方法。先用Trizol試劑提取移植瘤組織總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。5-LOX上游5′-TCATCGTGGACTTTGAGCTG-3′，下游5′-AGAAGGTGGGTGATGGTCTG-3′，產(chǎn)物262 bp；VEGF上游5′-GGGCCTCCGAAACCATGAACTT-3′，下游5′-TCGCATCAGGGGCACACAG-3′，產(chǎn)物260 bp。 β-actin上游5′-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3′，下游5′-ATGCATTCACCTCCCCTGTG-3′，產(chǎn)物 486 bp，均由上海invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)條件： 94℃ 5 min，94℃ 40 s、54℃ 55 s、72℃ 60 s，36個循環(huán)(5-LOX)或94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 40 s，30個循環(huán)(VEGF)，最后72℃延伸。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離。

四、 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、shRNA的抑瘤效應(yīng)

給予shRNA1和shRNA2 治療后，腫瘤的生長速度減慢，體積小于同時間的shNC 組和脂質(zhì)體組(圖1)。移植后第30天，shRNA1組平均腫瘤體積是用藥前的3.11倍，shRNA2組是2.84倍，shNC組是5.34倍，脂質(zhì)體組是7.01倍。shRNA1組、shRNA2組、shNC組和脂質(zhì)體組的瘤重分別為(32.5±19.0)mg、(30.1±14.1)mg、(50.5±15.6)mg和(71.7±25.4)mg；shRNA1組、shRNA2組、shNC組抑瘤率分別為54.7%、58.0%和29.5%。治療組與對照組相差顯著(P值均<0.05)。

圖1 各組腫瘤生長曲線

二、移植瘤5-LOX、VEGF蛋白表達(dá)的變化

5-LOX主要定位于移植瘤細(xì)胞的胞質(zhì)，在胞核及核膜上亦可見表達(dá)，呈棕黃色。shRNA1和shRNA2組移植瘤的5-LOX蛋白表達(dá)較shNC組和脂質(zhì)體組均顯著減少(表1，圖2)。但shRNA1和shRNA2組間無顯著差異；shNC和脂質(zhì)體組間也無顯著差異(表1)。VEGF主要定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中，血管周圍可見較強表達(dá)。shRNA1和shRNA2組移植瘤的VEGF蛋白表達(dá)較shNC和脂質(zhì)體組均顯著減少(表1，圖3)。但shRNA1和shRNA2組間無顯著差異；shNC組和脂質(zhì)體組間也無顯著差異。

表1 各組移植瘤5-LOX和VEGF蛋白的表達(dá)強度

圖2shRNA1組(a)、shRNA2組(b)、shNC組(c)和脂質(zhì)體組(d)胰腺癌移植瘤5-LOX蛋白表達(dá) (免疫組化 ×400)

圖3shRNA1組(a)、shRNA2組(b)、shNC組(c)和脂質(zhì)體組(d)胰腺癌移植瘤的VEGF蛋白表達(dá) (免疫組化 ×400)

三、移植瘤5-LOX、VEGF mRNA表達(dá)的變化

shRNA1和shRNA2組移植瘤的5-LOX mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)較shNC和脂質(zhì)體組均明顯減弱。但shRNA1和shRNA2組間未見明顯差異；shNC和脂質(zhì)體組間也未見明顯差異(圖4)。

圖4shRNA1組(a)、shRNA2組(b)、shNC組(c)和脂質(zhì)體組(d)胰腺癌移植瘤的5-LOX mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)

討 論

近年的研究表明，在胰腺癌組織、癌旁組織及其早期病變中均可見5-LOX的表達(dá)上調(diào)。Henning等[3]研究發(fā)現(xiàn)該基因在多種胰腺癌細(xì)胞中(PANC1、AsPC-1、MiaPaCa2)均有陽性表達(dá)，而在正常胰腺細(xì)胞中未見陽性表達(dá)，且5-LOX蛋白表達(dá)的強度與胰腺癌導(dǎo)管的分化程度呈正相關(guān)。國內(nèi)也有報道，提示5-LOX與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種5-LOX代謝途徑抑制劑MK886、雷公藤內(nèi)酯醇和5-LOX的反義寡核苷酸可抑制胰腺癌增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3,9-12]。新興的RNA干擾技術(shù)因其具有高度的特異性，即雙鏈RNA(dsRNA)特異地抑制、干擾RNA同源序列的靶基因表達(dá)，而對不相關(guān)序列的表達(dá)無干擾作用而成為目前國內(nèi)外研究的熱點，特別是在腫瘤基因治療以及抑制病毒復(fù)制等方面具有良好的應(yīng)用前景[13-14]。我們先期的研究從體外實驗的水平評價了5-LOX的shRNA治療對胰腺癌細(xì)胞的抑制作用，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染靶向5-LOX的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體可顯著下調(diào)5-LOX mRNA表達(dá)，也可以顯著抑制SWl990細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提示采用基因技術(shù)封閉5-LOX蛋白表達(dá)，可以達(dá)到治療目的[6]。本研究從體內(nèi)實驗的水平來進(jìn)一步研究靶向5-LOX的shRNA治療在胰腺癌方面的作用。結(jié)果顯示靶向5-LOX的shRNA可以明顯抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長，治療組中5-LOX、VEGF的蛋白和mRNA的表達(dá)均明顯低于對照組，提示靶向5-LOX的shRNA治療可以直接抑制5-LOX的表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的作用；也可以抑制VEGF的表達(dá)，抑制腫瘤血管的形成而起到間接抑制腫瘤生長的作用。

此次研究采用的方法為瘤內(nèi)注射，相比尾靜脈壓力注射以及腹腔內(nèi)注射給藥，該方法可以使藥物在瘤組織局部的濃度達(dá)到較高的水平，利于發(fā)揮治療作用。但由于注射時采用中心注射的方法，考慮到注射部位是否有局部壞死以及藥物通過壓力擴(kuò)散的程度不同，導(dǎo)致藥物吸收的程度不同，因此各治療組部分裸鼠移植瘤體積個體差異較大。提示在臨床應(yīng)用時應(yīng)考慮到給藥方式的優(yōu)化，以便可以使藥物定量穩(wěn)定地進(jìn)入瘤體內(nèi)，以發(fā)揮穩(wěn)定的抗腫瘤作用。

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2009-05-06)

(本文編輯：呂芳萍)

TheeffectofsmallhairpinRNAtargeting5-LOXonthegrowthoftumorxenograftsinthenudemice

QINJin-dan,ZHOUGuo-xiong,HUANGJie-fei,DINGXiao-ling,ZHANGHai-feng,ZHANGHong.

DepartmentofGastroeterology,AffiliatedHospital,NantongUniversity,Nantong226001,China

ZHOUGuo-xiong,Email:zhouguoxiong@medmail.com.cn

ObjectiveTo study the efficacy of RNA interference targeting 5-LOX on 5-LOX and VEGF expression as well as the growth of tumor xenografts in the nude mice, in order to evaluate the value of the clinical application.MethodsSW1990 cells were injected into the back of BALB/c nude mice. Once the visible tumors were evidenced about 100mm3, the animals were divided randomly into 4 groups (6 animals/group) and treated with shRNA1 and shRNA2 targeting 5-LOX, negatrve control shRNA(shNC) or control LipofectamineTM2000(Lipo) by intratumoral injection. Observing the effect of the shRNA on the growth of tumor xenografts, investigating the expression of 5-LOX and VEGF by immunohistochemistry and RT-PCR.ResultsTwo nude mice were dead in shNC group and Lipo group because of the wasting disease. Other nude mice had no changes in body weight, spirit, appetite, and activity. The growth of tumor xenografts was suppressed potently when administered with shRNA. Compared with shNC and Lipo group, the mean tumor size in groups treated with shRNA was reduced markedly at every point of test time. Between two treat groups, they did not have significant difference. 5-LOX and VEGF were both expressed in the pancreatic cancer tissue. The level of the 5-LOX expression in shRNA groups was stronger than that in shNC or Lipo group. The VEGF had the same situation. Between the two treat groups, the difference was not significant.ConclusionsRNA interference targeting 5-LOX can inhibit the growth of tumor tumor xenografts in the nude mice by depressing the expression of 5-LOX directly and depressing the expression of VEGF indirectly.

Pancreatic neoplasms; RNA interference; 5-Lipoxygenase; Vascular endothelial growth factor

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.008

江蘇省重點醫(yī)學(xué)人才項目(RC 2007085) 江蘇省衛(wèi)生廳重大課題(K200602)

226001 南通，南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化科

周國雄，Email:zhouguoxiong@medmail.com.cn