彭泉 蔡輝華 高文濤 錢祝銀 苗毅

·論著·

胰腺癌細(xì)胞系BxPC3及胰腺癌組織Ras相關(guān)區(qū)域家族1A啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)

彭泉 蔡輝華 高文濤 錢祝銀 苗毅

目的檢測(cè)Ras相關(guān)區(qū)域家族1A(Ras association domain family 1A, RASSF1A)在胰腺癌細(xì)胞株BxPC3及胰腺癌組織中的甲基化狀態(tài)，探討其啟動(dòng)子異常甲基化在胰腺癌發(fā)病機(jī)制中的可能作用。方法采用結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株BxPC3、5例正常胰腺組織、13對(duì)胰腺癌及相應(yīng)癌旁正常胰腺組織中RASSF1A啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)，計(jì)算其甲基化率。以甲基化酶抑制劑5-Aza-dC(5-Aza-2-deoxycitydine)處理BxPC3，觀察處理前后甲基化率變化情況及RASSF1A mRNA表達(dá)變化。結(jié)果在BxPC3細(xì)胞株中，RASSF1A啟動(dòng)子的CpG島甲基化率為62.90%；正常胰腺、癌旁及癌組織中平均分別為9.14%、53.79%和55.82%。與正常胰腺組織相比，胰腺癌旁及癌組織的RASSF1A啟動(dòng)子甲基化率明顯增高(P值lt;0.01)，而癌旁及癌組織之間無明顯差異(Pgt;0.05)。BxPC3經(jīng)5-Aza-dC處理后，RASSF1A的CpG島甲基化率顯著下降至42.50%(Plt;0.05)，同時(shí)RASSF1A mRNA表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論RASSF1A啟動(dòng)子CpG島異常甲基化是胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的早期事件，可能參與胰腺癌的發(fā)病過程。

胰腺腫瘤； 甲基化； CpG島

胰腺癌惡性程度較高，預(yù)后較差，其發(fā)病的分子機(jī)制至今不是十分清楚。研究顯示，遺傳表型改變，特別是抑癌基因啟動(dòng)子CpG島的異常甲基化與胰腺癌的發(fā)病關(guān)系密切[1-2]。人類Ras相關(guān)區(qū)域家族1A(RASSF1A)是從第3號(hào)染色體短臂3p21.3 克隆出來的腫瘤抑制基因，在許多腫瘤中表達(dá)缺失。在此，本研究定量分析RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)CpG島中的甲基化狀態(tài)，探討該基因異常甲基化與胰腺癌之間的關(guān)系。

材料和方法

一、DNA及RNA抽提

胰腺癌細(xì)胞BxPC3購(gòu)自上海市細(xì)胞庫(kù)，由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。常規(guī)培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每孔107個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后換液，加入含5 μmol/L 5-Aza-dC的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)96 h，每24 h更換同樣培養(yǎng)液。以不加5-Aza-dC的培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照組。應(yīng)用DNA提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)提取細(xì)胞DNA。應(yīng)用Trizol一步法提取總RNA。

收集南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科手術(shù)切除的13例胰腺癌及相應(yīng)癌旁正常胰腺組織和5例正常胰腺組織(均簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核)，取0.2 g置入研磨中加液氮研成粉末，分為兩份，分別按上述方法提取DNA和總RNA。

二、RASSF1A基因甲基化率檢測(cè)

采用結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combined bisulfite restriction analysis, COBRA)[3]檢測(cè)基因甲基化。參考Herman等[4]的方法，先將DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。以修飾后的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RASSF1A上游序列5′-GGGGGAGTTTGAGTTTATTGA-3′，下游序列5′-CTACCCCTTAACTACCCCTTCC-3′，PCR退火溫度為66℃，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)。以經(jīng)甲基化酶處理與未處理的正常人外周血細(xì)胞DNA分別作為陽性和陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后用HpyCH4Ⅲ酶切8 h，行聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，EB染色，成像。完全被酶切表示完全甲基化，出現(xiàn)2條帶：line2和line3；完全不被酶切表示無甲基化，出現(xiàn)1條帶：line1；部分被酶切表示部分甲基化，3個(gè)條帶均出現(xiàn)。Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，甲基化率(%)=2、3條帶灰度值/3個(gè)條帶總灰度值的百分值。

三、RASSF1A mRNA水平檢測(cè)

上游引物5′-GTGGAGCGGGACACGAA-3′,下游引物5′-GCTGTTGATCTGGGCATTGT-3′,以1 μg總RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度為63℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,成像。

四、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用上述同樣方法制備細(xì)胞爬片，進(jìn)行5-Aza-dC處理，應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

率的比較采用χ2檢驗(yàn)，Plt;0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞凋亡

經(jīng)5-Aza-dC處理后，BxPC3細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡(圖1)。

二、RASSF1A基因甲基化率

BxPC3細(xì)胞RASSF1A啟動(dòng)子CpG島甲基化率為62.90%，經(jīng)過5-Aza-dC處理后，甲基化率明顯下降到42.50%(Plt;0.05)。正常胰腺組織、胰腺癌組織和相應(yīng)癌旁正常胰腺組織RASSF1A啟動(dòng)子CpG島甲基化率分別為9.14%、55.82%、53.79%，癌及癌旁組織的甲基化率較正常胰腺組織明顯增高(Plt;0.01，圖2)

三、RASSF1A mRNA的表達(dá)

BxPC3細(xì)胞RASSF1AmRNA輕度表達(dá)，經(jīng)5-Aza-dC處理后，RASSF1A mRNA表達(dá)上調(diào)(圖3)。

圖1未處理組(a)和5-Aza-dC處理后(b)BxPC3細(xì)胞的凋亡(×400)

圖2正常細(xì)胞(N)、BxPC3細(xì)胞(B)、癌(T)和癌旁(Tp)組織的COBRA圖(+：陽性對(duì)照；-：陰性對(duì)照)

圖3BxPC3經(jīng)5-Aza-dC處理前后，RASSF1A mRNA的表達(dá)

討 論

如今的研究表明，表觀遺傳學(xué)改變已經(jīng)成為腫瘤研究中最重要的分子事件之一。表觀遺傳學(xué)主要包括DNA甲基化、基因印跡和組蛋白修飾。

RASSF1基因由于使用不同的剪接和啟動(dòng)子而有不同的轉(zhuǎn)錄本，包括RASSF1A、RASSF1B、RASSF1C，其中以RASSF1A最為重要，全長(zhǎng)1873 bp，含340個(gè)氨基酸的開放閱讀框，編碼產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量為38 800。RASSF1A作為抑癌基因的機(jī)制目前存在兩種觀點(diǎn)。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，RASSF1A從翻譯水平上抑制cyclinD1的聚集，阻斷cyclinD1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖旁路，從而阻止細(xì)胞從G1向S期轉(zhuǎn)變[5]。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，RASSF1A可能是Ras下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一個(gè)效應(yīng)物[6]，與Ras蛋白以三磷酸鳥苷依賴的形式相互作用，表現(xiàn)出受體活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-7]。

目前認(rèn)為，RASSF1A基因表達(dá)失活主要是與啟動(dòng)子區(qū)特異的高甲基化、雜合子丟失及染色體缺失有關(guān)[7-9]。同時(shí)可見DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶Ⅰ異常增高[10]。本文結(jié)果顯示，胰腺癌及癌旁組織的RASSF1A甲基化率明顯高于正常胰腺組織，而胰腺癌及癌旁之間無明顯差異。因?yàn)榘┡砸认俳M織在形態(tài)學(xué)上未見癌細(xì)胞，說明RASSF1A啟動(dòng)子異常甲基化對(duì)胰腺癌的發(fā)生發(fā)展來說可能是早期事件。

在胰腺癌細(xì)胞株BxPC3細(xì)胞中，RASSF1A啟動(dòng)子明顯甲基化(62.90%)，在mRNA少量表達(dá)。但經(jīng)過抑制甲基化后又重新表達(dá)。由于基因的序列沒有改變，且甲基化是可逆性的基因修飾過程，故可在胰腺癌或癌前病變中通過去甲基化處理，有可能對(duì)腫瘤的預(yù)防和及早治療發(fā)揮積極的作用。目前5-Aza-dC治療惡性血液病取得了顯著的療效[9]，這表明該藥有可能應(yīng)用于胰腺癌的治療。

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2009-07-22)

(本文編輯：呂芳萍)

AberrantmethylationofRasassociationdomainfamily1ApromoterCpGislandinpancreaticcancercelllineBxPC3andtissues

PENGQuan,CAIHui-hua,GAOWen-tao,QIANZhu-yin,MIAOYi.

DepartmentofGeneralSurgery,FirstAffiliatedHospital,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

QIANZhu-yin,Email：qianzhusilver@163.com

ObjectiveTo determine the methylation status and expression of Ras association domain family 1A (RASSF1A), and the possible effect between promoter aberrant methylation and pathogenesis of pancreatic cancer.MethodsThe methylation status of RASSF1A promoter CpG island (CGI) pancreatic cancer cell line BxPC3 was detected in 5 cases of normal pancreatic tissue and 13 pairs of pancreatic cancer tissues (tumor and peri-tumor) by using COBRA (combined bisulfite restriction analysis) and the methylation rate was calculated. The RASSF1A mRNA expression of BxPC3 was compared between pre- and post-treatment of the inhibitor of DNA methyltransferase (5-Aza-2-deoxycitydine, 5-Aza-dC).ResultsThe average methylation rate of RASSF1A promoter CGI was 62.90% in BXPC3, 9.14% in normal pancreas, 53.79% in peri-tumors (TP), and 55.82% in tumors. The methylation rates in peri-tumors and tumors were significantly increased when compared with that of normal pancreas (Plt;0.01)，while there was no significant difference between in peri-tumors and tumors (Pgt;0.05). After 5-Aza-dC treatting BxPC3 cells, the methylation rates decreased to 42.5% (Plt;0.05) and RASSF1A mRNA expression was enhanced.ConclusionsAberrant hypermethylation of RASSF1A promoter CGI could be considered as an early event in the process of pancreatic cancer and participates in the pathogenesis of pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; Methylation; CpG island

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.008

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30500492)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK2006241)

210029 南京，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科

錢祝銀，Email：qianzhusilver@163.com