張翠芳 趙秋 柯曉煜 廖宇圣

那可丁對(duì)人胰腺癌BxPC3細(xì)胞中HIF-1α及其靶基因VEGF表達(dá)的影響

張翠芳 趙秋 柯曉煜 廖宇圣

缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是一種在哺乳動(dòng)物組織中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子,它可誘導(dǎo)VEGF 轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)和表達(dá)增加,在腫瘤細(xì)胞的能量代謝、血管生成、促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中起重要作用[1]。因此，抑制HIF-1α可能作為惡性腫瘤治療的一個(gè)靶點(diǎn)。那可丁(noscapine)是一種阿片類生物堿。最新研究發(fā)現(xiàn)，那可丁能阻斷HIF-1α的表達(dá)。此外，它還有抗血管形成的作用[2]。本實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的那可丁在氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)缺氧的狀態(tài)下對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3細(xì)胞中HIF-1α、VEGF基因表達(dá)的影響，探討那可丁作為新的化療藥物治療胰腺癌的可行性。

一、材料和方法

1．細(xì)胞培養(yǎng)及分組：人胰腺癌BxPC3細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。常規(guī)培養(yǎng)傳代后分常規(guī)培養(yǎng)組，缺氧培養(yǎng)組，50、100、150 μmol/L那可丁處理組。缺氧培養(yǎng)是在5 ml含3%胎牛血清培養(yǎng)基中加入0.1 mol/L CoCl2(Sigma公司)母液12.5 μl，在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。那可丁處理組是在培養(yǎng)基中加入不同濃度那可丁及CoCl2后常規(guī)培養(yǎng)。24 h后采用Trizol一步法提取各組總RNA，用裂解液提取細(xì)胞總蛋白。

2．細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA檢測(cè)：采用RT-PCR方法。HIF-1α上游序列5′-GATGTAATGCTCCCCTCAC-3′，下游序列5′-GCTGGAATACTGTAACTGTGC-3′，擴(kuò)增片斷514 bp；VEGF上游序列5′-GAGGGCAGAATCATCACGAAG-3′，下游序列5′-CAGGCCCTCTTCTCATGGTA-3′，擴(kuò)增片斷402 bp；內(nèi)參β-actin上游序列5′-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游序列5′-GACTGCTGTCACCTTCACCGT-3′，擴(kuò)增片斷157 bp。引物由上海Sangon生物工程有限公司合成。先逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再行PCR。反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，31個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶光密度值之比作為mRNA相對(duì)表達(dá)量。

3．細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白檢測(cè)：采用Western blotting方法。鼠抗人HIF-1α單抗(Abcam公司)1∶ 300稀釋，兔抗人VEGF多抗和鼠抗人β-actin多抗(Bioscience公司)均1∶100稀釋，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG 1∶3000稀釋，最后ECL顯色，暗房曝光，洗片。

二、結(jié)果

1．細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)的變化：常規(guī)組、缺氧組和50、100、150 μmol/L那可丁組HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.39±0.07、1.01±0.06、1.03±0.06、1.02±0.04、0.99±0.08，CoCl2缺氧組細(xì)胞HIF-1α mRNA的表達(dá)明顯高于常規(guī)組(Plt;0.05)，而那可丁組細(xì)胞HIF-1α mRNA的表達(dá)與缺氧組比較無(wú)明顯變化(圖1)。

常規(guī)組、缺氧組和50、100、150 μmol/L那可丁組VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.65±0.04、0.94±0.04、0.63±0.04、0.45±0.04、0.21±0.05。缺氧組VEGF mRNA表達(dá)明顯增加(Plt;0.05)，那可丁組VEGF mRNA的表達(dá)呈劑量依賴性明顯下降(Plt;0.05)，且100、150 μmol/L那可丁組的VEGF mRNA表達(dá)還明顯低于常規(guī)組(Plt;0.05，圖1)。

2．細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)的變化：常規(guī)組、缺氧組和50、100、150 μmol/L那可丁組HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.08±0.03、0.81±0.04、0.54±0.05、0.38±0.04、0.15±0.03，缺氧組細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)明顯高于常規(guī)組(Plt;0.05)，而可丁組HIF-1α蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低(圖2)。

常規(guī)組、缺氧組和50、100、150 μmol/L那可丁組VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.40±0.02、0.79±0.04、0.63±0.05、0.26±0.04、0.13±0.04，缺氧組VEGF蛋白表達(dá)明顯增加(Plt;0.05)，而那可丁組VEGF蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性明顯下降(Plt;0.05，圖2)。

圖1各組細(xì)胞HIF-1α mRNA(上)、VEGF mRNA(中)和β-actine mRNA(下)的表達(dá)

圖2各組細(xì)胞HIF-1α蛋白(上)、VEGF蛋白(中)和β-actine 蛋白(下)的表達(dá)

討論氧平衡是哺乳動(dòng)物維持正常生長(zhǎng)發(fā)育和代謝的基礎(chǔ)，是維持細(xì)胞生存的重要因素。許多實(shí)體腫瘤具有缺氧的微環(huán)境。HIF-1α是在缺氧的細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種DNA結(jié)合蛋白，是介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧的微環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，由α亞單位和β亞單位構(gòu)成，分別位于人類第14號(hào)染色體q21224區(qū)和第1號(hào)染色體的q21區(qū)，其中α亞單位被認(rèn)為是特異性氧調(diào)節(jié)亞單位，決定HIF-1α的活性[3]。不同的腫瘤組織中,致癌基因多可通過(guò)HIF-1α表達(dá)升高上調(diào)VEGF的表達(dá),誘導(dǎo)新生血管形成，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[4-6]。

那可丁一直在人體中被作為沒(méi)有已知毒性作用的口服鎮(zhèn)咳藥[7-8]。有研究顯示，那可丁屬于植物代謝產(chǎn)物中的芐基異喹林類和(或)微管結(jié)合劑，是一個(gè)新HIF-1途徑小分子抑制劑[9-10]。用那可丁干預(yù)經(jīng)缺氧劑CoCl2處理的人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG和T98G細(xì)胞系，可抑制HIF-1α的表達(dá)。其機(jī)制可能抑制HIF-1α在核內(nèi)的積累以及通過(guò)蛋白酶體使它降解。微管結(jié)合劑的一個(gè)功能是它們與內(nèi)皮小管結(jié)合發(fā)揮抗血管形成的活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，那可丁對(duì)HIF-1α mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響，但可明顯抑制HIF-1α蛋白水平的表達(dá)，并且這種抑制作用與藥物濃度顯著相關(guān)，說(shuō)明那可丁是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控HIF-1α蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，那可丁呈濃度依賴性抑制VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)。由于那可丁對(duì)人體無(wú)毒性作用，可能為惡性腫瘤的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

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2009-03-06)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.022

435000 湖北黃石，黃石市中心醫(yī)院肝病科(張翠芳)；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科(趙秋、柯曉煜)；武漢市中心醫(yī)院消化內(nèi)科(廖宇圣)

趙秋，Email:Tongji146@sina.com