羅怡 吳繼紅 張圣海 徐萍 盧奕

·臨床研究·

老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β表達(dá)及其與晚期糖基化終末產(chǎn)物的相關(guān)性△

羅怡 吳繼紅 張圣海 徐萍 盧奕

目的研究轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)在老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者中的表達(dá)變化及其可能的作用機(jī)制,為進(jìn)一步闡明老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者發(fā)病的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法分別采用點(diǎn)雜交和實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)方法定量檢測和分析老年性白內(nèi)障患者及老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞中TGF-β蛋白、mRNA表達(dá)水平。免疫熒光方法觀察晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endoproducts，AGEs)對(duì)體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞TGF-β表達(dá)的影響。結(jié)果與老年性白內(nèi)障患者相比，老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞中TGF-β(TGF-β1/2/3)蛋白表達(dá)增加(Plt;0.05)，mRNA表達(dá)變化分別為TGF-β1升高(Plt;0.05)，TGF-β2降低(Plt;0.01)，TGF-β3未見顯著改變(Pgt;0.05)。AGEs與晶狀體上皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞表面TGF-β(TGF-β1/2/3)表達(dá)上調(diào)。結(jié)論TGF-β在老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)。AEGs可誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞TGF-β表達(dá)上調(diào)。(中國眼耳鼻喉科雜志，2010，10：212-214)

糖尿??； 白內(nèi)障； 晶狀體上皮細(xì)胞； 轉(zhuǎn)化生長因子β； 晚期糖基化終末產(chǎn)物

轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)可調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞的增殖和分泌，因而在老年性和后發(fā)性白內(nèi)障形成過程中起了重要作用。但TGF-β是否參與老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)生及其可能的作用機(jī)制，國內(nèi)外尚罕見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，研究老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者晶狀體上皮細(xì)胞TGF-β蛋白及mRNA的表達(dá)水平，初步探討TGF-β表達(dá)變化與晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endoproducts，AGEs)的相關(guān)性，為全面闡明老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者發(fā)病的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 選取2007年12月至2008年3月期間我科收治的老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者48例(經(jīng)內(nèi)科明確診斷為2型糖尿病,病史5年以上)，其中男性20例，女性28例；年齡60～82歲，平均(70.2±10.0)歲。老年性白內(nèi)障患者54例，其中男性20例， 女性34例；年齡54～80歲，平均(69.4±12.0)歲。術(shù)前排除青光眼、眼底視網(wǎng)膜脫離、葡萄膜炎、眼外傷等病變或其他內(nèi)眼手術(shù)史。糖尿病患者術(shù)前血糖均穩(wěn)定在8.2 mmol/L以下，老年性白內(nèi)障患者術(shù)前血糖為4.3～6.1 mmol/L，平均(5.2±0.9)mmol/L。全身檢查無特殊病變。

1.2 樣本采集 兩組分別經(jīng)我科行常規(guī)白內(nèi)障超聲乳化人工晶狀體植入手術(shù)取晶狀體前囊膜：術(shù)中用撕囊鑷行前囊膜環(huán)形撕囊，所得前囊膜大小為5～7 mm，立即置入去RNase酶的EP管中，-80 ℃保存待用。

1.3 晶狀體前囊膜TGF-β蛋白表達(dá)的檢測 晶狀體前囊膜經(jīng)組織裂解液裂解后，抽取蛋白，加熱變性。分別取2 μL上述蛋白樣品滴加在硝酸-纖維素膜上，室溫晾干。5%牛血清白蛋白封閉20 min后，一抗(Neomark, 1∶200)室溫孵育30 min。TBS/T漂洗3次，加入二抗(Invitrogen, 1∶500)室溫孵育30 min。最后以ECL化學(xué)發(fā)光劑(Thermo公司)孵育1 min，X線膠片曝光、顯影、定影。將5例前囊膜標(biāo)本合并為一個(gè)樣本。每組5個(gè)樣本，每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)2～3次。采用ImagePro 軟件進(jìn)行密度灰度值定量分析。

1.4 晶狀體前囊膜TGF-β亞型mRNA表達(dá)的定量分析 采用RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)分別制備兩組患者的晶狀體前囊膜總RNA。以β-actin作為內(nèi)參，所有待測樣本均做復(fù)孔，實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(ABI 7000，ABI公司，美國)檢測TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種亞型的mRNA表達(dá)。擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min預(yù)變性，然后按94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。各個(gè)樣本不同指標(biāo)的定量結(jié)果均用相應(yīng)的β-actin定量結(jié)果標(biāo)化。

表1 轉(zhuǎn)化生長因子β1/2/3基因上下游引物序列

注：TGF-β為轉(zhuǎn)化生長因子β

1.5 人晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cell, LEC)培養(yǎng)及AGEs干預(yù) 本研究所采用的人LEC為美國ATCC公司產(chǎn)品。采用補(bǔ)充了10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Gibco公司，美國)。預(yù)先將無菌的小玻片放置在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，分別按每孔2×105將LEC細(xì)胞接種在小玻片上，24 h后細(xì)胞貼壁。將終濃度為1、5、10 mg/mL的AGEs加入到LEC細(xì)胞的培養(yǎng)液中，隔天加1次。7 d后取出小玻片，以4%多聚甲醛固定20 min，用于免疫熒光檢測。

1.6 LEC細(xì)胞TGF-β表達(dá)的觀察 以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4)漂洗固定在小玻片的LEC細(xì)胞；加入磷酸鹽緩沖液稀釋的一抗TGF-β(NeoMarker公司，1∶200)，37 ℃孵育2 h；磷酸鹽緩沖液漂洗細(xì)胞3次，加入熒光二抗(Invitrogen公司，1∶500)，37 ℃孵育50 min；磷酸鹽緩沖液漂洗后加入DAPI孵育5 min，套染細(xì)胞核；Mowvil封片，正置熒光顯微鏡(Leica公司，德國)觀察熒光表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),單因素方差分析比較組間差異,以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者LEC中TGF-β的點(diǎn)狀范圍均較老年性白內(nèi)障患者的大，背景清晰(見附1頁圖①)。TGF-β在老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者LEC中的表達(dá)高于老年性白內(nèi)障 (Plt;0.05)。TGF-β1 mRNA 在老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者LEC內(nèi)的表達(dá)高于老年性白內(nèi)障，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；TGF-β2 mRNA表達(dá)則低于老年性白內(nèi)障(Plt;0.01)；TGF-β3 mRNA在LEC表面的表達(dá)峰度高，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，詳見表2和附1頁圖②。不同濃度的AGEs與人LEC共培養(yǎng)7 d后，TGF-β紅色熒光均較正常對(duì)照組增強(qiáng)(附1頁圖③)。

表2 轉(zhuǎn)化生長因子β三種亞型mRNA在兩組患者晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)(pg/mL)

3 討 論

糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制至今仍不明確。越來越多的研究表明，AGEs在老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[1]。然而AGEs如何介導(dǎo)以前囊膜下或后囊膜下纖維混濁為主要病變特點(diǎn)的老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)生，目前國內(nèi)外尚罕見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)臨床標(biāo)本的分析發(fā)現(xiàn)，老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者LEC中TGF-β表達(dá)較老年性白內(nèi)障患者顯著上調(diào)，其中mRNA表達(dá)上調(diào)以TGF-β1為主。體外研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AGEs可誘導(dǎo)LEC中TGF-β表達(dá)。這些結(jié)果提示，AGEs可能通過誘導(dǎo)LEC中TGF-β的表達(dá)而參與老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)生。

TGF-β有5種亞型,即TGF-β1～β5。 其中TGF-β1～β3存在于哺乳動(dòng)物中,TGF-β1和TGF-β2蛋白及其mRNA表達(dá)于絕大多數(shù)眼組織，TGF-β3僅表達(dá)于晶狀體上皮組織和纖維，房水和玻璃體中無表達(dá)，LEC中同時(shí)表達(dá)有3種TGF-β亞型的受體[2]。 TGF-β通過對(duì)LEC的影響，在后發(fā)性白內(nèi)障的形成中起了重要作用，此外在老年性核性和皮質(zhì)性白內(nèi)障的LEC中，TGF-β的含量不同，導(dǎo)致兩者的發(fā)病機(jī)制和病理改變不完全相同[3-5]。Liu等[6]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的大鼠晶狀體中加入TGF-β能誘導(dǎo)前囊膜下白內(nèi)障的發(fā)生。小鼠晶狀體纖維細(xì)胞中活性TGF-β過度表達(dá)也引起前囊膜下白內(nèi)障[7]。Mcavoy等[2]認(rèn)為TGF-β能通過促進(jìn)LEC間質(zhì)化來誘導(dǎo)白內(nèi)障。Lee和Joo[8]的實(shí)驗(yàn)表明,在前極性白內(nèi)障的LEC中TGF-β的表達(dá)顯著增加,并分析為TGF-β通過增強(qiáng)纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、平滑肌肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)而發(fā)揮作用。由此可見，TGF-β通過調(diào)節(jié)LEC的增殖和分泌在各種類型白內(nèi)障的發(fā)病中起了重要作用。筆者[9]曾報(bào)道TGF-β在老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者的前房液中含量的改變。本實(shí)驗(yàn)以老年性白內(nèi)障作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者LEC中TGF-β蛋白表達(dá)增加，同時(shí)通過體外實(shí)驗(yàn)探討了TGF-β表達(dá)上調(diào)的機(jī)制與AGEs有關(guān)，兩者可能是老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者發(fā)病機(jī)制分子鏈中的重要環(huán)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF-β2的mRNA在老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者前囊膜中表達(dá)較老年性白內(nèi)障者低。TGF-β2具有雙向功能:一方面對(duì)于胚胎層的細(xì)胞具有加速分裂增殖,另一方面又具有抑制細(xì)胞的作用。TGF-β2可通過調(diào)節(jié)LEC增殖狀態(tài),從而在白內(nèi)障發(fā)生過程中起重要作用。有研究[10-11]表明，老年核性白內(nèi)障組LEC中TGF-β2 mRNA的水平低于老年皮質(zhì)性白內(nèi)障組。老年核性白內(nèi)障的發(fā)生與LEC增殖有關(guān),而皮質(zhì)性白內(nèi)障的發(fā)生與LEC的退行性變有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：白內(nèi)障合并2型糖尿病患者的晶狀體TGF-β2 mRNA表達(dá)下降，LEC的增殖抑制作用減弱，與老年核性白內(nèi)障相似。

本實(shí)驗(yàn)探討AGEs、TGF-β與老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者發(fā)生的內(nèi)在相互聯(lián)系。在今后的實(shí)驗(yàn)中可深入研究老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者中TGF-β各亞型的表達(dá)變化及與AGEs的關(guān)系，為全面闡明老年性白內(nèi)障合并2型糖尿病患者的分子發(fā)病機(jī)制提供新的思路和數(shù)據(jù)。

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(本文編輯 諸靜英)

試題7.答案：B。UGH綜合征多發(fā)生于前房型人工晶狀體，也可見于后房型人工晶狀體。其原因?yàn)槿斯ぞ铙w或晶狀體襻與虹膜及房角不斷摩擦，從而引起頑固性葡萄膜炎、反復(fù)出血和繼發(fā)性青光眼。

Expressionoftransforminggrowthfactor-βinlensepithelialcellsofdiabeticcataractanditsrelationshipwithadvancedglycationendoproducts

LUOYi,WUJi-hong,ZHANGSheng-hai,XUPing,LUYi.

DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China

LU Yi,Email:luyi_eent@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of transforming growth factor-β(TGF-β) in the lens epithelial cells of diabetic cataract.MethodsAnterior capsule lens epithelial cells from the diabetic cataract patients and age-related cataract patients were extracted to detect TGF-β protein and mRNA expression by using dot blot and real-time polymerase chain reaction respectively. Observation of TGF-β expression of the lens epithelial cells after coculture of TGF-β and AGEs was done by method of immunofluorescence staining.ResultsProtein expression of TGF-β in the anterior capsule lens epithelial cells in the diabetic cataract significantly increased, compared to that in the age-related cataract. Regarding the mRNA expressions of the three subtypes of TGF-β, TGF-β1 mRNA expression increased(Plt;0.05), TGF-β2 mRNA decreased(Plt;0.01), and no significant change in TGF-β3 mRNA(Pgt;0.05) was found. TGF-β expression of lens epithelial cells enhanced after coculture with AGEs.ConclusionsThe expression of TGF-β in the lens epithelial cells of diabetic cataract significantly increased in comparison with the age-related cataract. The enhancement of TGF-β expression in the cultured lens epithelial cells was induced by AGEs. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2010,10:212-214)

Diabetes mellitus; Cataract; Lens epithelial cell; Transforming growth factor-β; Advanced glycation endoproducts

上海市科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目(08495801700)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031

盧奕(Email:luyi_eent@yahoo.com.cn)

2010-01-18)