朱莉 王紓宜 李詩敏

·臨床研究·

P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鱗癌中的表達(dá)及臨床意義

朱莉 王紓宜 李詩敏

目的探討P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測71例喉鱗狀細(xì)胞癌組織中P16INK4a和P14ARF蛋白的表達(dá)。結(jié)果71例喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中，35例(49.3 %)P16INK4a蛋白陰性，29例(40.8 %)P14ARF蛋白陰性，15例(21.1%) P16INK4a和P14ARF蛋白表達(dá)均陰性。P16INK4a和P14ARF蛋白陰性間無相關(guān)性(Pgt;0.05)。P16INK4a和P14ARF蛋白陰性率均與患者性別、年齡及臨床分期無相關(guān)性(Pgt;0.05)。P14ARF蛋白在I～I(xiàn)I期病例中強(qiáng)陽性占陽性比例為41.7%，在III～I(xiàn)V期中強(qiáng)陽性比例為11.1%。結(jié)論P(yáng)16INK4a和P14ARF在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生過程中起重要作用，兩種蛋白的失活是各自獨(dú)立的事件。P14ARF蛋白的缺失發(fā)生在喉鱗狀細(xì)胞癌早期。(中國眼耳鼻喉科雜志，2010，10：218-220)

喉腫瘤；鱗狀細(xì)胞癌；P16INK4a； P14ARF； 免疫組織化學(xué)； 蛋白表達(dá)

抑癌基因INK4a-ARF同時(shí)編碼P16INK4a和P14ARF蛋白，這兩個(gè)蛋白均為細(xì)胞周期調(diào)控因子,分別通過cyclin D-CDK4-PRB-E2F和MDM2-P53通路履行調(diào)控細(xì)胞周期的職責(zé)[1]。P16INK4a和P14ARF在喉鱗狀細(xì)胞癌中頻發(fā)失活,但迄今尚罕見兩者同時(shí)在喉鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)情況的報(bào)道。本科采用免疫組織化學(xué)EnVision方法對71例喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中P16INK4a和P14ARF蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測,探討二者各自及聯(lián)合表達(dá)陰性的臨床意義,為判斷喉鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后及選擇治療手段提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 腫瘤標(biāo)本來自本院1992—1999年經(jīng)病理證實(shí)的71例喉鱗狀細(xì)胞癌患者，其中男性 68例，女性3 例；年齡31～82歲。根據(jù)UICC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM臨床分期：I期27 例，II期 17例，III期19 例，IV期 8例。腫瘤病理分級：高分化21 例，中分化49 例，低分化1 例。另取30例癌旁正常喉黏膜組織(距癌灶邊緣2～3 cm)作為對照組。

1.2 方法 一抗體鼠抗人單克隆抗體P16INK4a購自美國Santa Cruz公司，兔抗人多克隆抗體P14ARF購自美國NeoMarkers公司。免疫組織化學(xué)檢測采用EnVision方法，二氨基聯(lián)苯胺顯色。操作步驟均按說明書進(jìn)行。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽性對照(已知陽性切片)和陰性對照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) P16INK4a蛋白陽性部位以細(xì)胞核為主，P14ARF蛋白陽性部位是細(xì)胞核，陽性顆粒呈棕黃色或黃褐色。根據(jù)P16INK4a及P14ARF在喉鱗狀細(xì)胞癌癌組織細(xì)胞中的反應(yīng)強(qiáng)度，半定量劃分反應(yīng)等級：陽性細(xì)胞lt;5%為陰性，5%～25%為弱陽性(+)，26%～50%為陽性(++)，≥51%為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)分析，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá) P16INK4a蛋白陽性(見附2頁圖①)36例，陰性35例,陰性率為49.3%； P14ARF蛋白陽性(見附2頁圖②)42例, 陰性29例,陰性率為40.8 %。對照組30例癌旁正常喉黏膜組織2種蛋白均呈陽性。喉鱗狀細(xì)胞癌組織中P16INK4a和P14ARF蛋白陰性率均明顯高于對照組(Plt;0.01)。

2.2 P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的共表達(dá) P16INK4a和P14ARF蛋白表達(dá)共陰性15例, 占21.1% (15/71)； P16INK4a陰性而P14ARF陽性20例，占28.2%(20/71)；P14ARF陰性而P16INK4a蛋白陽性14例, 占19.7 % (14/71)；P16INK4a或P14ARF蛋白單一陰性加共陰性表達(dá)占69.0%(49/71)。Spearman相關(guān)分析顯示，P16INK4a和P14ARF表達(dá)陰性相互間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.734)。

2.3 P16INK4a和P14ARF在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 P16INK4a和P14ARF蛋白陰性率在患者性別、年齡、臨床分期及病理分級間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05，見表1)。

表1 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中P16INK4a和P14ARF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 P14ARF蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌癌細(xì)胞中的反應(yīng)強(qiáng)度與臨床分期的關(guān)系 P14ARF蛋白在癌旁正常喉黏膜組織表達(dá)以弱陽性(+)為主，占陽性例數(shù)76.7%(23/30)，強(qiáng)陽性(+++)占6.7%(2/30)，在臨床I～I(xiàn)I期病例中強(qiáng)陽性(+++)占陽性比例為41.7 %(10/24)，弱陽性(+)占8.3 %(2/24)，在III～I(xiàn)V期病例中強(qiáng)陽性(+++)占陽性比例為11.1 %(2/18)，弱陽性(+)占61.1 %(11/18)。P14ARF蛋白在癌旁正常喉黏膜組織、I～I(xiàn)I期病例、III～I(xiàn)V期病例中染色強(qiáng)度不完全一致，組間強(qiáng)陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。

3 討 論

人類第9號染色體短臂2區(qū)1帶(9p21) 的INK4a-ARF基因位點(diǎn)有2個(gè)啟動(dòng)子，其中一個(gè)啟動(dòng)子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由外顯子Exon1α、Exon2、Exon3和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼P16INK4a蛋白；而另一個(gè)啟動(dòng)子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由外顯子Exon1β、Exon2、Exon3和2個(gè)內(nèi)含子組成, 編碼P14ARF蛋白。兩個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物閱讀框架互不相同[2],因而P16INK4a和P14ARF蛋白通過不同徑路(P16INK4a/PRB途徑、P14ARF/P53途徑)對細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用[3-4]。

INK4a-ARF是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種重疊編碼基因位點(diǎn), P16INK4a和P14ARF蛋白在功能上的相似與協(xié)調(diào)性,決定了該基因位點(diǎn)的重要生物學(xué)意義[5-6]。近年來已證實(shí)P16INK4a和P14ARF蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、乳腺癌、白血病、食管癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)頻發(fā)陰性[7-8]。目前，P16INK4a蛋白異常表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)性研究已取得了一定的進(jìn)展[9-10]。Jares等[11]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)P16INK4a蛋白及其mRNA表達(dá)的失調(diào)是喉癌中的頻繁事件, 且與基因改變及9p21區(qū)域的雜合性丟失有關(guān)。但有關(guān)P14ARF蛋白的研究報(bào)道不多，而且多數(shù)集中在體外細(xì)胞系培養(yǎng)方面[12-13]，在人類實(shí)體瘤特別是喉鱗狀細(xì)胞癌方面甚為少見。與此同時(shí)， P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌中共表達(dá)情況的研究，國內(nèi)外鮮見報(bào)道。

本研究重點(diǎn)探討了P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌中的各自及聯(lián)合表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)71例喉鱗狀細(xì)胞癌組織中P16INK4a和P14ARF蛋白陰性率分別為49.3%和40.8 %，對比癌旁正常喉黏膜組織中的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，P16INK4a或P14ARF蛋白單一陰性加共陰性比例為69.0%，說明喉鱗狀細(xì)胞癌組織中P16INK4a和P14ARF蛋白陰性率較高。由此推測，P16INK4a和P14ARF蛋白缺失可能與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)。本組喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本P16INK4a和P14ARF陰性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05),提示喉鱗狀細(xì)胞癌中P16INK4a和P14ARF蛋白表達(dá)是各自獨(dú)立的事件,這可以從它們具有不同的啟動(dòng)子得到解釋。71例喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中有15例P16INK4a和P14ARF蛋白同時(shí)缺失，這一現(xiàn)象與P16INK4a和P14ARF基因處于同一位點(diǎn)的物理特點(diǎn)有關(guān)。P16INK4a和P14ARF蛋白陰性率在患者性別、年齡、臨床分期及病理分級間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，提示其臨床意義有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來研究證實(shí)。P14ARF蛋白在癌旁正常組織表達(dá)以弱陽性為主(占陽性例數(shù)76.7%)，強(qiáng)陽性僅占6.7%，而在I～I(xiàn)I期病例中強(qiáng)陽性占優(yōu)勢(占陽性比例為41.7%)，發(fā)展到III～I(xiàn)V期時(shí)又以弱陽性為主(占61.1%)，強(qiáng)陽性只占11.1%。P14ARF蛋白這種在腫瘤早期表達(dá)增強(qiáng)的現(xiàn)象提示P14ARF基因在腫瘤形成早期發(fā)揮更重要的作用，即試圖通過其擴(kuò)增來加強(qiáng)P14ARF/P53途徑對細(xì)胞周期的調(diào)控，以期阻止細(xì)胞的惡性增殖。

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(本文編輯 楊美琴)

ExpressionandsignificanceofP16INK4aandP14ARFproteinsinlaryngealsquamouscellcarcinoma

ZHULi,WANGShu-yi,LIShi-min.

DepartmentofPathology,EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China

LI Shi-min,Email:lishimin@163.com

ObjectiveTo study the expression and clinical significance of P16INK4aand P14ARFproteins in laryngeal squamous cell carcinoma.MethodsThe expression of P16INK4aand P14ARFproteins was detected in 71 carcinoma samples by immunohistochemistry (EnVision method).ResultsThe negative expression of P16INK4aand P14ARFwas detected in 35 samples(49.3 %)and 29 samples(40.8 %) respectively. While 15 cases(21.1 %)showed simultaneous loss in both proteins. Rank correlation analysis revealed that there was no correlation between negative expression of P16INK4aand P14ARFproteins in carcinoma(Pgt;0.05). The negative expression rate of P16INK4aor P14ARFwas unrelated to the clinical data including gender, age and clinical stage. The overpositive proportion of all P14ARFpositive cases in stage I to II was 41.7% and 11.1% in stage III to IV.ConclusionsThe aberrance of P16INK4aand P14ARFgene might be associated with the oncogenesis of carcinoma. There was no correlation between negative expression of P16INK4aand P14ARFproteins in carcinoma. Moreover, the loss of P14ARFprotein occurred in the early stage of carcinoma. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2010,10:218-220)

Laryngeal neoplasm; Squamous cell carcinoma; P16INK4a; P14ARF; Immunohistochemistry; Protein expression

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院病理科 上海 200031

李詩敏(Email:lishimin@163.com)

2010-01-05)