何小丹 姜 丹 陳 琛 儲艷秋 丁傳凡,*

翁志潔2 李建其2,*

(1復旦大學化學系激光化學研究所,上海市分子催化和功能材料重點實驗室,上海 200433; 2上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040)

抗抑郁化合物SIPI5358與環(huán)糊精形成的非共價復合物

何小丹1姜 丹1陳 琛1儲艷秋1丁傳凡1,*

翁志潔2李建其2,*

(1復旦大學化學系激光化學研究所,上海市分子催化和功能材料重點實驗室,上海 200433;2上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040)

用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)和串級質(zhì)譜(MS/MS),并結(jié)合紫外光譜、熒光光譜等方法,研究一種芳烷醇哌嗪類抗抑郁化合物SIPI5358與α-、β-、γ-環(huán)糊精(CD)制備得到的非共價復合物.質(zhì)譜分析結(jié)果顯示,SIPI5358分子可以和α-CD生成配合比為1∶1的非共價復合物,而與β-、γ-CD生成不同配合比的非共價復合物.串級質(zhì)譜的結(jié)果進一步驗證β-CD與SIPI5358非共價復合物的組成.用紫外光譜和熒光光譜實驗對液相中非共價復合物的形成進行了輔助研究,結(jié)果均再次驗證了非共價復合物的生成.熒光光譜實驗測得SIPI5358與β-CD反應的生成常數(shù)Kf=3.45×103mol·L-1.

環(huán)糊精;抗抑郁;非共價復合物;紫外光譜;電噴霧電離質(zhì)譜;熒光光譜

抑郁癥是一種常見的精神科的疾病,易于復發(fā),需連續(xù)長時間服藥,目前已成為全球范圍內(nèi)精神科自殺率最高的疾病之一.普遍公認的治療抑郁癥藥物包括單胺氧化酶抑制劑(MAOI)和三環(huán)類抗抑郁藥(TCA)在內(nèi)的第一代抗抑郁藥,和以選擇性五羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑為主的第二類抗抑郁藥[1-2].單胺氧化酶抑制劑類藥物曾一度廣為應用,不久因引起高血壓等嚴重副作用而被淘汰;而第二類抑郁藥物大多具有阻斷多種遞質(zhì)受體的效果,可能擾亂多種神經(jīng)傳導.因此,高效、低毒、副作用少的新藥成為了研究的焦點.SIPI5358是上海醫(yī)藥工業(yè)研究院的李建其課題組根據(jù)藥物作用靶點,定向設計和合成的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型抗抑郁活性化合物,屬于芳烷醇哌嗪衍生物[3],是針對5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)及多巴胺(DA)再攝取過程定向設計合成的分子,已經(jīng)在動物實驗中達到了預期的三重選擇性抑制作用,體現(xiàn)出顯著的抗抑郁活性,其不良反應較常規(guī)抗抑郁藥物少,起效更快,是一種很有開發(fā)前景的化合物.然而,由于SIPI5358水溶性較差,目前尚不能達到臨床應用的要求,因此需要尋找新的方法來增加SIPI5358的溶解度.

環(huán)糊精(cyclodextrin,簡稱CD)[4]是由環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶作用于淀粉或直鏈環(huán)糊精而形成的一類環(huán)狀低聚糖,它是一種水溶性、非還原性、不易被酸水解、無毒、可食用、具有多孔性的白色晶體.常見的環(huán)糊精有α-CD、β-CD以及γ-CD 3種,它們分別由6-8個葡萄糖單元以1,4-糖苷鍵結(jié)合而成的[5].由于連接葡萄糖單元的糖苷鍵不能自由旋轉(zhuǎn),環(huán)糊精分子不是直筒狀的圓柱體結(jié)構(gòu),而是呈現(xiàn)兩端直徑不同的圓筒形結(jié)構(gòu),其中環(huán)糊精的伯羥基圍成了圓筒形的小口,而其仲羥基圍成了圓筒形的大口.具有這種特殊結(jié)構(gòu)的環(huán)糊精分子外緣親水而內(nèi)腔疏水,可以作為主體分子(host)包絡各種適當?shù)目腕w分子(guest),如有機分子等,通過疏水作用、氫鍵和范德華力等與嵌入疏水孔洞的客體分子組合成單分子非共價復合物[6-8].前人已經(jīng)成功地用環(huán)糊精和藥物結(jié)合形成非共價復合物的方法包合了抗腫瘤和抗高血壓等藥物[9-10]來提高藥效.因此,可以嘗試采用制備環(huán)糊精和SIPI5358非共價復合物來提高其溶解度.

近年來,非共價復合物在醫(yī)藥上得到了廣泛的應用,實驗表明,一些小分子與生物大分子均能生成非共價復合物[11-13],許多分析技術(shù)包括紫外-可見分光光度法、熒光光譜、核磁共振光譜[14]等都被用于檢測非共價復合物.質(zhì)譜技術(shù)憑借其高靈敏度、高精度和高速度的優(yōu)勢[15-18],有效地推動了非共價復合物的研究[19-23].例如Terrier等[24]在對該復合物進行碰撞誘導解離(CID)時,發(fā)現(xiàn)非共價復合物的電荷態(tài)和多聚堿性氨基酸的性質(zhì)不同會導致不同的解離途徑.最近,Liu等[25]用電噴霧質(zhì)譜研究了22個黃酮類化合物(其中9個黃酮苷元,13個黃酮糖苷)與DNA三鏈形成非共價復合物,結(jié)果顯示苷元的羥基位置、多糖的數(shù)量和黃酮類苷元的骨架在與DNA三鏈結(jié)合中起至關(guān)重要的作用,而糖苷展示比其相應的苷元對DNA三鏈有更高的鍵合能力.

SIPI5358,SIPI5357[26]和SIPI5838[27]分子結(jié)構(gòu)的特點是都具有哌嗪母體,兩端分別為苯基和萘基的系列衍生物,它們都具有抗抑郁活性,其中SIPI5838已進入臨床前研究階段[1].本實驗室已經(jīng)采用電噴霧質(zhì)譜結(jié)合紫外光譜成功地研究了SIPI5357[26]和SIPI5838[27]與α-、β-CD形成的非共價復合物,質(zhì)譜測量結(jié)果表明,SIPI5357、SIPI5838分子均可以與環(huán)糊精分子生成配合比(1∶1)的非共價復合物.這些非共價復合物的形成可以顯著地提高該抗抑郁化合物在水溶液中的溶解度.動物實驗表明藥物水溶解度的提高可以有效地減小該抗抑郁化合物在體內(nèi)的沉積,使得它們具有臨床使用的可能.另外,紫外分光光度法的輔助研究表明非共價復合物可以在液相中生成.溶解度實驗計算了SIPI5357、SIPI5838和兩種環(huán)糊精分子在液相中的生成常數(shù),表明非共價復合物的穩(wěn)定程度為β-CD-SIPI5838＞α-CD-SIPI5838,β-CD-SIPI5357＞α-CD-SIPI5357.

前人研究結(jié)果[28]顯示當客體分子為塊狀或長鏈化合物時,可能會形成一分子CD與兩分子客體或一分子客體與兩分子CD相結(jié)合的復合物,例如雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium,簡稱DS)和β-CD形成的復合物中,不僅含有配合比1∶1的β-CD-DS產(chǎn)物,還含有配合比1∶2或2∶1的β-CD-DS產(chǎn)物.SIPI5838分子的兩端分別為苯基和萘基,與CD分子相比,具有長鏈化合物的特點,具有形成2∶1的β-CDSIPI5838復合物的潛在可能性.然而,哌嗪類SIPI系列抗抑郁化合物形成的復合物可能有哪幾種配合比到目前為止還沒有完全明白,這引起了我們的研究興趣.此外,以前的工作主要是針對哌嗪類抗抑郁化合物和α-、β-CD非共價復合物的研究,但尚未涉及γ-CD的研究,而且抗抑郁化合物SIPI5358和β、γ-CD非共價復合物的穩(wěn)定性尚不明確.

本文在前面工作[27]的基礎上,將采用電噴霧質(zhì)譜等技術(shù)研究SIPI5358和α-、β-、γ-CD之間的非共價相互作用,確定有幾種不同配合比的復合物,用熒光和紫外光譜法證明藥物和環(huán)糊精在液相中的反應,并用熒光光譜法測定β-CD和SIPI5358反應的生成常數(shù).

1 實驗部分

1.1 化學試劑

實驗中所用的α-CD(純度98%),β-CD(純度98%),γ-CD(純度99%)購于Sigma化學試劑公司(St.Louis,MO,USA),分子量分別為∶α-CD,972.86; β-CD,1134.98;γ-CD,1297.15.甲醇(純度99.5%).抗抑郁化合物SIPI5358由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供(純度99%),相對分子質(zhì)量467.1(不包含2HCl· 2H2O),其結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

1.2 非共價復合物的制備

將SIPI5358溶于甲醇中,配成1×10-3mol·L-1的溶液a,將α-、β-、γ-CD分別溶于去離子水中,配成1×10-3mol·L-1的溶液,依次為溶液b、c、d.取1 mL溶液a分別和不同體積的溶液b、c、d混合,均配成5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5摩爾比的混合溶液,所有混合樣品用50%(體積比)的甲醇稀釋至10 mL后搖勻,得到三套不同摩爾比的反應液,放入30℃的恒溫箱內(nèi)反應24 h.取上述SIPI5358分別與α-、β-、γ-CD混合的三種反應液(1∶5)各1 mL進行混合,并用50%(體積比)的甲醇稀釋至10 mL可得到混合溶液A.分別取5 mL溶液b、c、d和3 mL溶液a進行混合,用50%(體積比)的甲醇稀釋至30 mL即溶液B,將溶液B在30℃恒溫箱內(nèi)反應24 h,即可得到SIPI5358同時與α-、β-、γ-CD反應的混合溶液B.

溶液a、b、c、d均用50%(體積比)的甲醇稀釋至1×10-4mol·L-1,作為參比液.所制備的溶液用于電噴霧電離質(zhì)譜、串級質(zhì)譜、紫外光譜、熒光光譜的測定.

1.3 電噴霧電離質(zhì)譜的測定

質(zhì)譜測定所用的儀器裝置為電噴霧電離-三重四極桿質(zhì)譜儀(API III Plus,PE-Sciex,加拿大,m/z 2400).質(zhì)譜儀的質(zhì)量標定選用聚丙二醇(PPG)標準樣品.所用的助噴霧氣和簾氣均為高純氮氣(99.999%).以1.2 μL·min-1的進樣速度進行電噴霧電離產(chǎn)生樣品離子.

1.4 串級質(zhì)譜分析

為了探討SIPI5358溶液和環(huán)糊精所生成的非共價復合物結(jié)構(gòu),我們還對質(zhì)譜測量中所得到的非共價復合物離子進行了串級質(zhì)譜分析,測量了此非共價復合物離子的碰撞誘導解離產(chǎn)物,所用的碰撞氣體為高純氬氣.碰撞能量數(shù)值由四級桿Q0和碰撞池Q2的電壓差[n(R0-R2)]計算而得,其中n為母離子電荷數(shù),R0和R2分別為離子導引四極桿Q0和碰撞池Q2上的直流電壓.

1.5 紫外光譜的測定

紫外-可見分光光度計(Agilent8453,Agilent公司,美國).紫外光譜在室溫下測得,樣品的光譜掃描范圍190-260 nm.

1.6 熒光光譜的測定

熒光分光光度計(Cary Eclipse,Varian公司,美國).熒光光譜波長范圍∶激發(fā)態(tài)200-900 nm.將熒光分光光度計設置為激發(fā)光柵和發(fā)射光柵都是5 nm,電壓600 V,激發(fā)波長為280 nm,掃描速率600 nm·min-1.然后各取1.5 mL溶液a和溶液c放入石英比色皿中,立即放入熒光光度計中從開始掃描熒光發(fā)射譜圖.從300 nm掃到500 nm,起初每間隔1 min掃描一次,直到熒光強度變化不大時開始擴大間隔.

1.6.2 用熒光光度計測定SIPI5358與β-CD的生成常數(shù)

每次取1 mL溶液a,依次與1、2、3、4、5、6、7、8 mL溶液c分別混合,共8組溶液,用50%(體積比)的甲醇溶液稀釋到10 mL,重復3次.將上述混合液在30℃恒溫箱中放置24 h.熒光光度計掃描設定及掃描范圍同上.

2 結(jié)果與討論

2.1 α-、β-、γ-CD和SIPI5358的質(zhì)譜測量結(jié)果

α-、β-、γ-CD和SIPI5358在電噴霧電離質(zhì)譜圖中均以帶一分子水的單電荷離子存在,即[α-CD+ H3O]+、[β-CD+H3O]+、[γ-CD+H3O]+和[SIPI5358+H]+.它們的質(zhì)譜峰m/z分別出現(xiàn)在991.0、1153.1、1315.2和467.8處.

2.2 α-、β-、γ-CD和SIPI5358的非共價復合物

質(zhì)譜測量結(jié)果

選取我院2016年6月～2018年6月收治的624例危重疾病患者，回顧分析其臨床資料：①男377例，女247例；②年齡16～92歲，平均（59.25±12.34）歲。

α-CD與SIPI5358以5∶1混合反應后得到的質(zhì)譜圖如圖2所示,m/z=1440.5所對應的分子離子為[α-CD+SIPI5358+H]+離子,它表明,α-CD與SIPI5358之間有新的復合物生成.前人[28]曾經(jīng)報道環(huán)糊精分子是含有較多羥基的低聚糖化合物,故SIPI5358客體分子和環(huán)糊精主體分子之間的結(jié)合力主要可能為氫鍵和疏水力.

β-CD和SIPI5358以5∶1混合反應后得到的質(zhì)譜圖如圖3所示,形成的非共價復合物以及兩者的配合比均能夠從ESI質(zhì)譜圖上得出.值得注意的是, β-CD與SIPI5358混合反應后得到的質(zhì)譜圖(圖3a)中除了生成兩者配合比為1∶1的復合物之外,還有配合比為1∶2、2∶1兩種形式存在.圖3a中的三個離子的放大圖分別列于圖3(b,c,d),其中m/z=1035.5所對應的質(zhì)譜峰為[β-CD+2SIPI5358+2H]2+離子(見圖3b),m/z=1377.8所對應的質(zhì)譜峰為[2β-CD+ SIPI5358+H2O+2H]2+離子(見圖3c),m/z=1602.6所對應的質(zhì)譜峰為[β-CD+SIPI5358+H]+離子(見圖3d).與文獻[27]中結(jié)構(gòu)類似的SIPI5838比較,可以發(fā)現(xiàn)SIPI5838也可以與兩分子β-CD反應,并生成m/z= 1348.6的[2β-CD+SIPI5838+2H]離子,SIPI5358分子中哌嗪的鄰位連的是丁基,而SIPI5838分子中哌嗪的鄰位連的是甲基,烷基基團的空間位阻對哌嗪衍生物與β-CD的結(jié)合也許會產(chǎn)生一定的影響,對這個問題還需做更多的工作才能作明確的解釋.

γ-CD與SIPI5358以5∶1混合反應后得到的質(zhì)譜圖如圖4所示.圖4a為γ-CD與SIPI5358按5∶1混合反應后得到的質(zhì)譜圖,圖4a中的三個離子的放大圖分別列于圖4(b,c,d),其中圖4a中m/z=1116.1所對應的質(zhì)譜峰為[γ-CD-2SIPI5358+2H]2+離子(如圖4b),m/z=1539.9所對應的質(zhì)譜峰為[2γ-CD+ SIPI5358＋H2O+2H]2+離子(如圖4c),m/z=1764.2所對應的質(zhì)譜峰為[γ-CD+SIPI5358+H]+離子(如圖4d).上述結(jié)果表明,同β-CD與SIPI5358形成的非共價復合物的結(jié)果類似,γ-CD與SIPI5358之間形成的復合物也是以1∶2、1∶1、2∶1三種形式存在.

綜合比較圖2-4中相同摩爾比反應物得到的1∶1復合物的質(zhì)譜峰強度,可以看出γ-CD與SIPI5358反應強于α-,β-CD和SIPI5358反應,即三種環(huán)糊精和藥物結(jié)合的程度依次為γ-CD＞β-CD＞α-CD.這一結(jié)果可能與環(huán)糊精的分子的大小以及SIPI5358的結(jié)構(gòu)有關(guān).α-、β-、γ-CD的空腔容積分別為0.174、0.262和0.427 nm3,也就是說空腔內(nèi)徑 γ-CD＞β-CD＞α-CD.在CD包合物中,化合物被包在CD的空腔中,通常將CD稱為主體,而把進入其空腔內(nèi)的化合物稱為客體.作為主體的CD與客體分子形式包合物的一個基本要求是尺寸的匹配,即對SIPI5358分子中的有機基團具有識別能力.一般而言,由于α-、β-、γ-CD的空腔尺寸依次增大,可以穩(wěn)定包結(jié)不同大小的分子,如α-CD的空腔尺寸適合包結(jié)單環(huán)芳烴,β-CD空腔尺寸適合包結(jié)萘環(huán),而γ-CD的空腔尺寸適合包結(jié)苾、蒽等.由于SIPI5358分子中的兩端含有一個苯基和一個帶有—OCH3和—Cl的萘基,因此β-、γ-CD容易與萘基結(jié)合,而α-CD容易與苯基結(jié)合,導致三種環(huán)糊精和SIPI5358結(jié)合后生成的1∶1復合物穩(wěn)定程度依次為γ-CD＞β-CD＞α-CD,該結(jié)果也被溶解度實驗所證實[29],在該文中根據(jù)Higuchi-Connors法測得的SIPI5358與γ-CD、β-CD或α-CD形成的復合物的結(jié)合常數(shù)分別為175.2、29.2、15.4 mol·L-1.

2.3 α-、β-、γ-CD和SIPI5358按各種比例混合后的質(zhì)譜檢測

為了確認SIPI5358與環(huán)糊精生成的為特異性結(jié)合的非共價復合物,而不是分子團簇離子,我們將α-、β-、γ-CD和SIPI5358按摩爾比為5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5的不同比例混合后進行質(zhì)譜檢測后發(fā)現(xiàn),改變反應物的配比會影響質(zhì)譜峰的相對強度,但不會改變質(zhì)譜峰m/z的位置,可見反應物的初始反應比不影響最終產(chǎn)物的生成,只影響復合物的相對生成量.它說明了SIPI5358與環(huán)糊精生成的為特異性結(jié)合的非共價復合物,而不是非特異性結(jié)合的分子團簇離子,因為反應物的初始濃度比將會決定團簇離子的大小,從而改變質(zhì)譜峰的位置.

2.4 混合液A和B質(zhì)譜測量結(jié)果

為了比較α-、β-、γ-CD和藥物SIPI5358同時反應時相互之間的競爭關(guān)系,我們配制兩種不同的溶液.溶液A為3份SIPI5358先與α-、β-、γ-CD分別按摩爾比1∶5反應,然后再將反應液混合在一起的混合溶液;而溶液B為3份SIPI5358同時與α-、β-、 γ-CD反應的混合溶液B(摩爾比,nSIPI5358∶nCD=3∶5).溶液A和溶液B的質(zhì)譜圖分別如圖5a和圖5b所示.對比圖5a和5b，發(fā)現(xiàn)兩張圖中出現(xiàn)了三種環(huán)糊精和藥物按1∶1、1∶2、2∶1結(jié)合的主要產(chǎn)物.

圖5 混合溶液A(a)和B(b)電噴霧電離質(zhì)譜圖Fig.5 ESI-MS of mixture solutions A(a)and B(b) solution A:the reactant mixture of excess SIPI5358 with equimolar α-CD,β-CD,γ-CD,respectively;solution B:an equimolar mixture of α-CD,β-CD,γ-CD with excess SIPI5358

令人感興趣的是在α-CD、β-CD、γ-CD三種環(huán)糊精中任意兩種不同CD均可以與一個SIPI5358分子相結(jié)合并生成相應的產(chǎn)物,它們分別為m/z=1297.0所對應的[α-CD+β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+分子離子、m/z=1377.8所對應的[α-CD+γ-CD+SIPI5358+ H2O+2H]2+分子離子、m/z=1459.0所對應的[γ-CD+ β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+分子離子.值得一提的是在圖5中m/z=1539.9所對應的[2γ-CD+SIPI5358+ H2O+2H]2+分子離子峰卻未觀察到,其主要原因可能是因為當一分子γ-CD與SIPI5358結(jié)合之后,較大的空洞內(nèi)徑使得另一γ-CD分子與SIPI5358分子中的苯基的鍵合作用不如β-CD或α-CD的強.

圖5a和5b中兩兩對應的質(zhì)譜峰的相對強度發(fā)生了明顯的變化.在圖5b中,α-、β-CD和藥物結(jié)合的一價離子峰增強,即m/z=1440.5所對應[α-CD+ SIPI5358+H]+離子、m/z=1602.6所對應的[β-CD+ SIPI5838+H]+離子信號增強;另外多種二價離子的信號也增強,m/z=1035.5所對應的[β-CD+2SIPI5358+ 2H]2+離子、m/z=1377.8所對應的[2β-CD＋SIPI5358+ H2O+2H]2+離子以及m/z=1116.1所對應的[γ-CD+ 2SIPI5358+2H]2+離子和 m/z=1297.0所對應的[α-CD+β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+離子峰強度均增強,其余的峰強度無明顯變化.說明α-、β-、γ-CD同時和SIPI5358反應,與三種環(huán)糊精分別和藥物反應結(jié)果是不同的,表明環(huán)糊精之間存在明顯的競爭關(guān)系.

2.5 串級質(zhì)譜分析結(jié)果

為了進一步確認β-CD和SIPI5358之間非共價復合物分子的組成,我們選擇了β-CD+SIPI5358混合溶液中的[2β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+和[β-CD-2SIPI5358+2H]2+產(chǎn)物離子進行了串級質(zhì)譜分析,即選出m/z=1377.8對應的[2β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+和m/z=1035.5對應的[β-CD+2SIPI5358+2H]2+離子作為前驅(qū)體離子進行碰撞誘導解離(CID)過程和產(chǎn)物分析,結(jié)果如圖6所示.

碰撞能量固定為70 eV(＞70 eV,SIPI5358會解離),碰撞氣體密度CGT=80×1013molecules·cm-2.如圖6a所示,來自于前體離子[β-CD+2SIPI5358+2H]2+(m/z=1035.5)的斷裂碎片離子m/z=1602.6和m/z= 467.8分別可以歸屬于為[β-CD+SIPI5358+H]+和 [SIPI5358+H]+.進一步增大碰撞氣體CGT至100× 1013molecules·cm-2,前體離子[β-CD+2SIPI5358+2H]2+完全解離,m/z=1035.5的離子峰信號消失,由此可見, m/z=1035.5對應的前體離子是β-CD和SIPI5358按配合比1∶2結(jié)合的復合物.碰撞能量固定70 eV, CGT=80×1013molecules·cm-2時,[2β-CD+SIPI5358+ H2O+2H]2+的CID實驗的質(zhì)譜圖見(圖6b).圖6b中可以發(fā)現(xiàn)源于m/z=1377.8對應的前體離子[2β-CD+ SIPI5358+H2O+2H]2+的斷裂碎片離子m/z=467.8和m/z=1153.1,它們分別可以歸屬于[SIPI5358+H]+和[β-CD+H2O+H]+離子,沒有出現(xiàn)β-CD和SIPI5358按配合比1∶1結(jié)合的[β-CD-SIPI5358+H2O+H]+離子.根據(jù)串級質(zhì)譜圖6可以推斷β-CD和SIPI5358反應以后可以生成復合物,β-CD與SIPI5358在復合物中的配合比可以為1∶2或2∶1.

需要強調(diào)的是長期以來用電噴霧質(zhì)譜在氣相中測得的非共價復合物質(zhì)譜信號能否直接代表溶液中的產(chǎn)物還存在一定的爭議[30].在電噴霧過程中解離或生成分子團簇(cluster)離子可能會造成測得的結(jié)果與溶液中的實際情況產(chǎn)生差異,在特定條件下電噴霧過程中可能會發(fā)生非特異性結(jié)合[31].一些重要的情況列舉如下:(1)某些非特異性結(jié)合的復合物離子比特異性結(jié)合的離子在動力學上要穩(wěn)定;(2)某些復合物離子從溶液轉(zhuǎn)移到氣相的過程中會發(fā)生離子相互作用強化而疏水作用弱化;(3)在分析試劑濃度較高時,會發(fā)生質(zhì)譜信號相互抑制作用.例如, Klassen等[32]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)對一個給定濃度的糖和碳酸酐酶(carbonic anhydrase)而言,單糖、二糖以及親水的糖容易在納升噴霧過程中與碳酸酐酶形成非特異性結(jié)合.然而,非特異性結(jié)合對碳酸酐酶的結(jié)構(gòu)以及復合物的電荷態(tài)均不敏感,而且結(jié)合的配體數(shù)也遠大于復合物的電荷態(tài).因此,下面結(jié)合傳統(tǒng)的溶液分析技術(shù)如紫外光譜等確認非共價復合物的形成.

2.6 SIPI5358分別與α-,β-,γ-CD形成的復合物

的紫外光譜圖

為了驗證SIPI5358可以和α-,β-,γ-CD在溶液中形成非共價復合物,而不是在氣相中形成的的分子團簇,我們還測定了由SIPI55358和α-,β-,或γ-CD制備而成的復合物溶液的紫外光譜.

圖8 SIPI5358與β-CD混合物在不同反應時間的熒光光譜圖Fig.8 Fluorescence spectra for the mixture of SIPI5358 and β-CD with different reaction time

在實驗中我們選用190-260 nm區(qū)間對α-,β-, γ-CD和SIPI5358以及它們1∶1混合后經(jīng)反應得到的混合物溶液進行紫外光譜的檢測,結(jié)果見圖7.

在圖7A中,曲線a,b分別代表α-CD溶液和SIPI5358溶液所測得的紫外光譜,曲線d則為兩者進行簡單理論疊加后應該出現(xiàn)的光譜,曲線c為實際測得兩者混合后的光譜圖.從圖中可以看到,如果藥物SIPI5358和α-CD是簡單疊加,則應該在192.0 nm處都會出現(xiàn)較強的吸收.而實際得到的混合物吸收峰則發(fā)生了一定的偏移,即在192.5 nm處出現(xiàn)較強吸收,除了峰位置發(fā)生偏移外,峰形也有變化,說明將SIPI5358和α-CD混合后,再進行紫外光譜的檢測,得到的紫外光譜不是反應物簡單的疊加,而是有新物質(zhì)生成.類似地β-CD與SIPI5358反應在193.1 nm處出現(xiàn)較強吸收(圖7B),γ-CD與SIPI5358反應在193.0 nm處出現(xiàn)較強吸收(圖7C).γ-CD或β-CD與SIPI5358反應后混合物吸收峰相對于簡單疊加的偏移均約為1.1 nm,大于α-CD與SIPI5358反應后混合物吸收峰的偏移(0.5 nm).紫外光譜的結(jié)果表明CD和SIPI5358在溶液中可以生成非共價復合物,而γ-CD或β-CD與SIPI5358的結(jié)合強度要略大于α-CD.

圖9 藥物SIPI5358和不同濃度β-CD混合物的熒光光譜圖Fig.9 Fluorescence emission spectra of SIPI5358 and β-CD with different concentrationscSIPI5358=1×10-4mol·L-1;104cβ-CD/(mol·L-1)∶(a)0,(b)1.0,(c)2.0,(d)3.0, (e)4.0,(f)5.0,(g)6.0,(h)7.0,(i)8.0

表1 SIPI5358與β-CD結(jié)合的生成常數(shù)和擬合線性方程Table 1 Linear equations and Kfvalues of β-CD with SIPI5358

2.7 藥物SIPI5358與β-CD混合后的熒光光譜測定結(jié)果

從質(zhì)譜的結(jié)果來看,β-CD和藥物SIPI5358的反應情況較好,于是用熒光光譜進一步驗證β-CD和藥物SIPI5358相互反應及測定反應的生成常數(shù).

圖8中,對應0 min的曲線是未加β-CD的空白藥物溶液,濃度也是1×10-4mol·L-1.從圖8可以看出,隨著反應時間的增加,藥物SIPI5358和β-CD混合以后,混合溶液的熒光強度會有所增加,說明在發(fā)射波長為366 nm時生成了一種熒光更強的物質(zhì),證明兩者發(fā)生了反應,反應10 min以后熒光強度幾乎無變化,因此推測這一系列反應都屬于快反應.

2.8 用熒光光度計測定SIPI5358與β-CD復合物的生成常數(shù)

圖9為SIPI5358在1×10-4mol·L-1的濃度下與不同濃度β-CD(反應的熒光譜圖blank是未加環(huán)糊精的空白藥物,濃度單位均為mol·L-1).通過下式計算出β-CD和SIPI5358反應的生成常數(shù)和擬合線性方程列于表1.

其中F0是空白溶液的熒光強度,F∞為所有SIPI5358完全反應時的溶液的熒光強度.生成常數(shù)的平均值為Kf=3.45×103mol·L-1.

3 結(jié) 論

應用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)、串級質(zhì)譜(MS/ MS)并結(jié)合紫外光譜、熒光光譜技術(shù),研究了新型抗抑郁化合物SIPI5358(客體分子)與α-,β-,γ-CD(主體分子)所形成的非共價相互作用.實驗結(jié)果表明,在溶液中,SIPI5358與α-,β-,γ-CD可以生成較為穩(wěn)定的非共價復合物.使用ESI-MS及MS/MS技術(shù),能夠確定三種環(huán)糊精與SIPI5358之間非共價復合物的生成,并且可以快速和準確地確定復合物中主客體分子之間的配合比.研究證實藥物SIPI5358可以和α-CD生成1∶1結(jié)合的產(chǎn)物,與β-,γ-CD則可以分別生成配合比為1∶2、1∶1、2∶1的非共價復合物.將三種環(huán)糊精和藥物一起反應時,可以看出三種環(huán)糊精和藥物之間的反應存在明顯的競爭關(guān)系.另外,紫外光譜和熒光光譜實驗測得的結(jié)果和ESI-MS得到的結(jié)果較為吻合,均證明在溶液中有新的復合物生成.用熒光光譜測得的生成常數(shù)Kf為3.45×103mol·L-1.本文的實驗結(jié)果為今后利用質(zhì)譜等技術(shù)研究環(huán)糊精與其他藥物分子的非共價復合物打下了基礎,并為以后解決提高藥物溶解度的問題提供了新的思路和理論依據(jù).

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∶March 5,2010;Revised∶June 7,2010;Published on Web:July 13,2010.

Non-Covalent Complexes of the Antidepressant Compound SIPI5358 with Cyclodextrins

HE Xiao-Dan1JIANG Dan1CHEN Chen1CHU Yan-Qiu1DING Chuan-Fan1,*WENG Zhi-Jie2LI Jian-Qi2,*
(1Shanghai Key Laboratory of Molecular Catalysis and Innovative Materials,Institute of Laser Chemistry, Department of Chemistry,Fudan University,Shanghai200433,P.R.China;2Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry,Shanghai 200040,P.R.China)

Non-covalent complexes of α-,β-,and γ-cyclodextrin(CD)with the antidepressant compound SIPI5358 were investigated by electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS),tandem mass spectrometry(MS/MS),UV spectroscopy,and fluorescence spectroscopy.The ESI-MS experimental results revealed that SIPI5358 reacted with the α-,β-,and γ-CD to form complexes with different coordination numbers.The tandem mass spectra further confirmed the formation of non-covalent complexes of SIPI5358 with β-CD.Binding of the complexes was also confirmed by UV as well as fluorescence spectra.The formation constant Kfwas determined by fluorescence spectroscopy to be 3.45×103mol·L-1for the complex of SIPI5358 and β-CD.

Cyclodextrin;Antidepressant;Non-covalent complex;UV spectroscopy; Electrospray ionization mass spectrometry;Fluorescence spectroscopy

O641;O645

*Corresponding authors.DING Chuan-Fan,Email:cfding@fudan.edu.cn;Tel:+86-21-65105204.LI Jian-Qi,Email:lijq@sipi.com.cn.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(30772623)and National Project in Significant Creation of New Drugs During the Eleventh Five-Year Plan Period,China(2009ZX09103-047).

國家自然科學基金(30772623)及國家十一五項目重大新藥創(chuàng)制(2009ZX09103-047)資助項目