于廣新，張鐵楠，張理濤，紀(jì)巖文

（1.天津市長征醫(yī)院，天津300120 2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300158）

塵螨是引起人類變態(tài)反應(yīng)性疾病的主要變應(yīng)原之一[1]。使用塵螨的主要變應(yīng)原來檢測塵螨過敏和進(jìn)行免疫生物治療是防治塵螨過敏性疾患的重要手段。在以往的研究中我們發(fā)現(xiàn)，中國大陸粉塵螨2類變應(yīng)原的基因序列具有多態(tài)性，存在著一定的地域性差異[2]。因此，文中采用RT-PCR的方法，繼續(xù)擴(kuò)增中國大陸地區(qū)的粉塵螨Der f1cDNA片斷并進(jìn)行序列分析，為進(jìn)一步表達(dá)重組的Der f1變應(yīng)原以用于塵螨過敏性疾病的診治或構(gòu)建DNA疫苗打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 高速冷凍離心機(jī)：Heraeus公司。微量離心機(jī)：Heraeus公司。U-2001紫外分光光度儀：Hitachi公司。PCR 擴(kuò)增儀 TP3000：Takara Bio-inc公司。凝膠電泳儀Mupid：Advance-BioCoLtd公司。

1.1.2 主要試劑 DNA Maker DL-2000：TaKaRa公司。Trizol試劑：Invitrogen 公司。DEPC：上海生工。低熔點(diǎn)瓊脂：Gibcol BRL公司。DNA Ligation Kit Ver：Takara公司。DNA片段純化與回收試劑盒：DNA Fragment Purification Kit Ver 2.0 Takara公司。BKL Kit：Takara 公 司 。 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 ：AMV Reverse Transcriptase，Takara公司。逆轉(zhuǎn)錄引物：Oligo dTAdaptor Primer：Takara公司。PCR應(yīng)用試劑來自Takara公司。SacI限制性內(nèi)切酶:Takara公司。NotI限制性內(nèi)切酶:TaKaRa公司。

1.1.3 數(shù)據(jù)分析軟件 DNAStar、電泳成像裝置ImageMasterVDS：Pharmacia Biotech公司。

1.1.4 質(zhì)粒 pMD18-T Simple平滑載體和pET-32a(+)載體，來自Takara公司。

1.1.5 大腸桿菌 E.coli Competent JM109 Cell，來自TaKaRa公司。

1.1.6 引物設(shè)計(jì)與合成 檢索Genebank上的Der f1序列(AB034946)，去除內(nèi)含子后自行設(shè)計(jì)粉塵螨特異性引物。由大連寶生物公司合成。引物序列為：5′－AGC GCT TGC CGT ATC AAT TCG GTT AAC－3′和5′－GAGGTTGTTTCCGGCTTGGAAATATC－3′。

1.1.7 粉塵螨 中國大陸粉塵螨標(biāo)準(zhǔn)株（Dermatophagoides farinae）購自復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物系。

1.2 方法

1.2.1 粉塵螨基因組總RNA提取 -70℃保存的粉塵螨過篩除去面粉，迅速放入勻漿器中，加Trizol試劑2mL，常規(guī)方法提取組織RNA。用50μL的無RNA酶的DEPC水溶解RNA，用移液槍吹打充分溶解后，取2μL進(jìn)行1%瓊脂糖電泳。結(jié)果見圖1。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 以提取的總 RNA為模板，Oligo dT-Adaptor Primer為反轉(zhuǎn)錄引物，使用TaKaRa RNA LA PCRTM Kit（AMV）Ver 1.1進(jìn)行RT反應(yīng)，合成cDNA。20μL反應(yīng)體系組成為：MgCl2，4 μL；10 ×RNA PCR Buffer，2μL；dNTP Mixture，2μL；RNase inhibiter，0.5μL；模板 RNA，5μL；AMV Reverse Transcriptase，1μL；Oligo dT-Adaptor Primer，1μL；DEPC-H2O，4.5μL。反應(yīng)混合液輕微混合，并短暫離心聚集，按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min。

1.2.3 PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因 以合成的cDNA為模板，使用PyrobestTMDNA Polymerase，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。50μL 反應(yīng)體系組成：10×Pyrobest Buffer，5μL；dNTP Mixture，5μL；上下游引物各 1μL；cDNA，2μL；Pyrobest DNA Polymerse(5U/μL)，0.5μL；DDW，35.5 mL。PCR反應(yīng)條件：變性94℃1 min；退火50℃1 min；延伸 72℃ 1 min；35個(gè)循環(huán)。取 5μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳。結(jié)果見圖2。

1.2.4 PCR產(chǎn)物回收 使用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit切膠回收目的基因。

1.2.5 目的DNA片段的末端平滑及5’末端磷酸化反應(yīng) 應(yīng)用TaKaRa公司的BKL Kit進(jìn)行。

1.2.6 末端平滑及5’末端磷酸化目的DNA片段的純化 用TaKaRaDNAFragmentPurificationKitVer2.0純化DNA。取1μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳。結(jié)果見圖3。

1.2.7 目的DNA片斷與載體連接 使用TaKaRa DNA Ligation Kit中的 SolutionⅠ，連接 DNA與pMD18-T Simple平滑載體。

1.2.8 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 首先制備大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞：取連接液（16℃）10 μL，加 100 μL 感受態(tài)細(xì)胞 E.coli JM109，混合均勻后置于冰上30min（冰上操作）。放入42℃水浴1min。迅速移至冰浴中2～3min。加入900 μL SOC培養(yǎng)基，混勻移入15 mL管中，37℃搖床中溫育1h。12 000r/pm離心1min，將沉淀溶于100 μL上清中，在超凈臺中涂布于AIX平板上，放37℃溫箱中過夜。

1.2.9 陽性克隆篩選和培養(yǎng) 挑取陽性菌落，分別用滅菌牙簽挑取菌落的1/2，移至3mL加Amp的TB培養(yǎng)基中，37℃、220～240轉(zhuǎn)搖床過夜。

1.2.10 質(zhì)粒提取 用Takara Minibest Plasmid Purification Kit完成。取1μL質(zhì)粒做1%瓊脂糖電泳，獲得兩株質(zhì)粒。電泳結(jié)果見圖4。

1.2.11 DNA策序分析 將篩選出的1、2號兩株質(zhì)粒分別命名為質(zhì)粒1和質(zhì)粒2，以BcaBEST Primer M13-47、BcaBEST Primer RV-M為引物進(jìn)行DNA測序。本實(shí)驗(yàn)部分由TaKaRa中國大連公司完成。

2 結(jié)果

2.1 克隆的Derf1cDNA片斷的核苷酸序列分析 篩選出的兩株Der f1的cDNA克隆為長度631個(gè)堿基對的核苷酸片斷。序列結(jié)果與Genebank上公布的Der f1序列 (AB034946)經(jīng)blast分析后，其中一株（質(zhì)粒1）與Der f1序列(AB034946)完全相同，具有100%的同源性；另一株（質(zhì)粒2）與Der f1序列(AB034946)分別在144、481兩處位點(diǎn)有堿基不同，有99.7%的同源性。見圖5。

2.2 克隆的Der f1 cDNA片斷的氨基酸序列分析：氨基酸序列分析表明：質(zhì)粒1所能產(chǎn)生的氨基酸序列與基因庫中的完全相同；而質(zhì)粒2可能產(chǎn)生1種氨基酸突變。見圖5。

圖5 Der f1 cDNA序列（atg為起始密碼）

3 討論

在目前分離提純的12類塵螨變應(yīng)原當(dāng)中，每一類都有不同的的酶活性，而不同塵螨之間的同一類變應(yīng)原的氨基酸序列和cDNA序列有較高的同源性。1類變應(yīng)原是塵螨變應(yīng)原重要的組成部分，具有巰基蛋白酶的活性，不耐熱。Mr為25KDa，PI為4.5～7.2，最佳溫度條件為37℃，pH為6.0。與過敏者血清IgE結(jié)合率為80%～100%。Der p1（戶塵螨1類變應(yīng)原）與Der f1理化性質(zhì)相似，氨基酸序列高度同源，有80%序列是一致的[3]。因此在診斷和治療上各種塵螨過敏有著共同性。但cDNA文庫隨機(jī)片段免疫篩選發(fā)現(xiàn)抗原差異的區(qū)域與序列差異的區(qū)域相對應(yīng)[4]，cDNA的差異決定著氨基酸序列的差異。

至少有4種塵螨變應(yīng)原具有蛋白水解酶活性。此類酶可通過非細(xì)胞毒性作用造成上皮細(xì)胞間的破壞，使變應(yīng)原輕易通過氣道黏膜和皮膚屏障，和免疫細(xì)胞接觸，導(dǎo)致機(jī)體針對塵螨的超敏反應(yīng)[5]。Derf1可以切斷B細(xì)胞表面的CD23，消除IgE合成的抑制信號，從而誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生超敏反應(yīng)。粉塵螨IgE抗體陽性的患者血清中大多含有Der f1特異性抗體，其中兒童69%，成人87%[6]，因此Der f1是主要的塵螨變應(yīng)原。

戶塵螨Der p1第1～4位殘基互不相同，常常發(fā)生保守性改變。這種改變往往發(fā)生在個(gè)別的核苷酸和氨基酸序列。因此不會導(dǎo)致戶塵螨變應(yīng)原的大的改變，但有時(shí)這種改變可以改變抗原的血清型，這在不同地區(qū)來源的塵螨表現(xiàn)明顯[7]。因此，有必要對這種變化和地域差異進(jìn)行研究。但是粉塵螨的這種變化不是太明顯，臨床發(fā)現(xiàn)，使用國內(nèi)的粉塵螨變應(yīng)原進(jìn)行皮膚試驗(yàn)和應(yīng)用CAP system檢測特異性IgE比較，二者具有較好的相關(guān)性[8]。我們采用RTPCR所獲得的2株Der f1 cDNA片斷和Genebank上公布的Der f1序列相比較，其中1株完全一致，1株僅有2個(gè)堿基差異，推測只能產(chǎn)生1種氨基酸突變，提示中國大陸Der f1與國際已知序列高度同源。這不僅為上述臨床應(yīng)用提供了遺傳學(xué)的證據(jù)，同時(shí)也為開拓我國及不同地域的同一類變應(yīng)原的特點(diǎn)分析、以及為進(jìn)一步表達(dá)重組的變應(yīng)原用于塵螨變應(yīng)性疾病的診治奠定了基礎(chǔ)。

[1]Thomas WR,Smith WA,Hales BJ,et al.Characterization and immunobiology of house dust mite allergens[J].Int Arch Allergy Immunol,2002,129:1-18.

[2]張理濤，紀(jì)巖文，張鐵楠，等.粉塵螨2類變應(yīng)原基因的克隆和序列分析[J].天津醫(yī)藥，2008，36（9）:666-668.

[3]Medeiros MJr,FigueiredoJP,Almeida MC,et al.Association between mite allergen （Der p 1,Der f 1,Blo t 5）levels and microscopic identificationofmitesorskinpricktestresultsinasthmaticsubjects[J].IntArchAllergyImmunol,2002,129:237-241.

[4]Cui Y,Zhou P,Peng J,et al.Cloning,sequence analysis,and expression of cDNA coding for the major house dust mite allergen,Derf1,inEscherichiacoli[J].BrazJMedBiolRes,2008,41:380-388.

[5]Chen CL,Lee CT,Liu YC,et al.House dust mite Dermatophagoides farinae augments proinflammatory mediator productions and accessory function of alveolar macrophages:implications for allergic sensitization and inflammation[J].J Immunol,2003,170:528-536.

[6]YasuedaH,Saito A,Nishioka K,etal.Measurement of Dermatophagoides miteallergens on beddingandhuman skin surfaces [J].Clin Exp Allergy,2003,33:1654- 1658.

[7]Kikuchi Y,Takai T,Kuhara T,et al.Crucial commitment of proteolytic activity of a purified recombinant major house dust mite allergen Der p1 to sensitization toward IgE and IgG responses[J].J Immunol,2006,177:1609-1617.

[8]賴乃揆，侯小清，鄒澤紅.104例支氣管哮喘患者血清五種螨類特異性 IgE 檢測的結(jié)果分析[J].中華內(nèi)科雜志，1998，37（9）：589-591.