李家速,趙宜香綜述,姚忠祥審校

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅四隊(duì),重慶400038;2.第三軍醫(yī)大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室,重慶400038;3.中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院09453班,江蘇南京211198)

2006年,Takahashi和Yamanaka[1]研究小組利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將Oct3/4、Sox2、c-myc和 Klf4四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(four transcription factors,4TFs)導(dǎo)入小鼠已分化的成纖維母細(xì)胞,再應(yīng)用小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESc)培養(yǎng)條件將其去分化,重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPS)。iPS在形態(tài)結(jié)構(gòu)、表面標(biāo)志物、增殖分化和畸胎瘤形成等方面與ESc極為相似,因此,其在移植免疫排斥、干細(xì)胞治療、組織器官再生以及法律倫理學(xué)等方面極具優(yōu)勢。自此以后,iPS便成為多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),在誘導(dǎo)的因子、載體安全性、效率等方面都取得了舉世矚目的成果。本文將對(duì)iPS誘導(dǎo)重編程的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS的必要因子

Takahashi和Yamanaka[1]研究小組證實(shí)了4TFs的組合可以誘導(dǎo)iPS的產(chǎn)生,但誘導(dǎo)的效率較低,安全性方面也存在風(fēng)險(xiǎn),因此這些轉(zhuǎn)錄因子是否具有可替代性,是否均為必要因子等問題還有待深入研究。

Yu等[2]利用慢病毒載體介導(dǎo)Oct4、Sox2、Nanog和Lin28 4種轉(zhuǎn)錄因子,成功誘導(dǎo)胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有人ESc特征的iPS;Zhou等[3]則利用腺病毒介導(dǎo) Ngn3、Pdx1、M afa 3種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染成年動(dòng)物的胰腺外分泌細(xì)胞,成功轉(zhuǎn)化為胰島B細(xì)胞;而Huangfu等[4]只用 Oct4、Sox2就生成了人成纖維細(xì)胞的iPS,說明Oct4、Sox2在誘導(dǎo)重編程的過程中是必需的。Kim等[5-6]利用單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct4的異位表達(dá),即人為操縱外源基因Oct4的導(dǎo)入和表達(dá),成功誘導(dǎo)人胎兒神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS,證實(shí)Oct4在分子水平誘導(dǎo)多潛能性方面不僅是必要的而且是能夠勝任的,實(shí)現(xiàn)了單因子誘導(dǎo)iPS的創(chuàng)舉。Oct4是多能干細(xì)胞的標(biāo)記物,被認(rèn)為是只在多能干細(xì)胞中高水平表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,通過外源性信號(hào)分子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,與內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子Nanog、Sox2等共同組成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以維持干細(xì)胞的多能性,因其作用的多樣性和表達(dá)的特異性而被認(rèn)為是控制干細(xì)胞多能性的決定性因素[7]。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將Oct4導(dǎo)入胎兒神經(jīng)干細(xì)胞,嵌入鼠內(nèi)細(xì)胞群,并在人ESc條件下培養(yǎng),直到ESc樣克隆能被機(jī)械分離和進(jìn)一步增殖分化,并通過多種篩選手段證實(shí)單因子Oct4誘導(dǎo)產(chǎn)生的該iPS無論是在基因表達(dá)譜、表觀遺傳學(xué)特征還是在體內(nèi)外的全能性上,都與人ESc非常相似。這項(xiàng)成果將極大地推進(jìn)對(duì)重編程機(jī)制的理解和制備患者特異性多潛能干細(xì)胞的研究。

有研究通過同時(shí)利用多種因子的不同組合重編程神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞模型,證實(shí)Oct4和Klf4已經(jīng)足夠誘導(dǎo)出神經(jīng)干細(xì)胞的多潛能性[8]。但是由于所需外源因子個(gè)數(shù)不確定和重編程目標(biāo)細(xì)胞的異質(zhì)性等原因,重編程潛在的分子機(jī)制還是不完全明了。

2 低毒性或無毒性載體的使用

最早得到的iPS是經(jīng)由原癌基因c-myc或其蛋白產(chǎn)物生成的,Klf4也牽涉致癌作用,而且是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及慢病毒來介導(dǎo)的,易導(dǎo)致外來因子異位表達(dá)整合入宿主細(xì)胞的基因組,存在變異、自身基因表達(dá)調(diào)節(jié)失調(diào)、移植后腫瘤形成等風(fēng)險(xiǎn),從而阻礙其未來的臨床應(yīng)用。最近的研究利用DNA轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒及游離載體等,誘導(dǎo)成功后剔除外源性插入物,在iPS安全性方面取得了突破性進(jìn)展。

Kaji等[9]以含有遺傳序列DNA片段的轉(zhuǎn)座子替代病毒作為多蛋白表達(dá)載體,在CAG增強(qiáng)子的驅(qū)動(dòng)下,將串聯(lián)在2A寡肽序列上的4TFs同時(shí)導(dǎo)入鼠和人多能性標(biāo)記物高表達(dá)的成纖維細(xì)胞,成功獲得iPS后又利用Cre重組酶瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng),將外源性重組因子尤其是 c-myc切除,降低了致癌風(fēng)險(xiǎn),極大地增強(qiáng)了iPS在再生醫(yī)學(xué)、藥物篩選和構(gòu)建疾病模型等方面的應(yīng)用性。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于載體擁有自我剪切的能力,可以在移植后被剔除,但此途徑重組效率偏低,還有待進(jìn)一步研究。

Soldner等[10]利用Cre重組酶在生成iPS后將外源性重組因子去除,盡管保持了iPS的可塑狀態(tài),但依舊不能避免殘余插入物導(dǎo)致的基因突變。Woltjen等[11]采用相似的不依賴病毒的單一化轉(zhuǎn)座子piggyBac表達(dá)載體,介導(dǎo)可誘導(dǎo)的特殊轉(zhuǎn)錄因子多西環(huán)素(doxycycline),易化導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組,產(chǎn)生穩(wěn)定的iPS;接著他們利用具有天然屬性的piggyBac系統(tǒng)轉(zhuǎn)座酶的瞬時(shí)表達(dá),無痕跡地去除iPS的外源性插入物即致癌基因,從而使生成的iPS更安全和高效。

由此可見,2A寡肽序列的應(yīng)用不僅使得誘導(dǎo)所需的轉(zhuǎn)錄因子在單一結(jié)構(gòu)上遞送,而且使得外來結(jié)構(gòu)的完全切除變得更加容易。這項(xiàng)新技術(shù)在加速重編程機(jī)制的深入研究和未來的細(xì)胞治療方面有重大意義。倘若與micro RNA、基因標(biāo)記等技術(shù)結(jié)合起來,安全效果可能會(huì)更好。

Okita等[12-13]使用兩個(gè)質(zhì)粒作為載體,一個(gè)質(zhì)粒包含編碼Oct3/4、Klf4和Sox2的cDNAs,另一個(gè)含有編碼c-myc的cDNAs。前者連接在來自致病病毒的、可自行分裂的2A寡肽序列上,通過質(zhì)粒反復(fù)轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,經(jīng)PCR篩選,可獲得無功能性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的iPS,移植入裸鼠可以生成畸胎瘤,以及促成成熟嵌合體。這種在質(zhì)粒介導(dǎo)下生成iPS的方法,對(duì)闡明重編程和全能性的潛在機(jī)制意義重大。但此法的速度較慢,效率仍然較低,至于是否適用于其他組織器官和物種還有待于進(jìn)一步研究。

Jia等[14]則在已有質(zhì)粒編碼 POU5F1(即 OCT4)、SOX2、LIN28和NANOG的基礎(chǔ)上,外加一個(gè)GFP報(bào)告基因的2A序列,基于PhiC31的分子內(nèi)重組系統(tǒng)除去或退化細(xì)菌質(zhì)粒主鏈,再將其純化和分離,獲得minicircle載體,即一種具有超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA分子,誘導(dǎo)多潛能性的人脂肪干細(xì)胞,從而獲得無轉(zhuǎn)基因的人iPS。和單純質(zhì)粒相比,由于外源性沉默機(jī)制活性的降低,此法具有更高的轉(zhuǎn)染率和異位基因表達(dá)能力,因此被認(rèn)為可能是iPS生成的理想策略。Yu等[15]則使用無需整合的游離載體,生成的iPS完全脫離載體和轉(zhuǎn)基因序列,在增殖和分化潛能方面與人ESc十分相似。此外,選擇恰當(dāng)?shù)捏w細(xì)胞也對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPS的安全性極為關(guān)鍵。Miura等[16]用11種途徑合成了36個(gè)鼠iPS,通過形成次級(jí)神經(jīng)球(secondary neurospheres)來評(píng)估畸胎瘤形成的機(jī)制。為了搞清楚這些次級(jí)神經(jīng)球在體內(nèi)的表現(xiàn)特征,將這些次級(jí)神經(jīng)球移植入實(shí)驗(yàn)鼠大腦,并進(jìn)一步解剖檢測畸胎瘤的形成。來自鼠ESc的3個(gè)克隆移植入34只鼠腦后,有3只死亡,其中1只形成畸胎瘤,發(fā)病率為2.9%;來自鼠胚胎樣成纖維細(xì)胞的12個(gè)iPS移植入100只鼠腦后,有33只形成大小不等的畸胎瘤,發(fā)病率為33.0%;而來自鼠尾尖成纖維細(xì)胞的11個(gè)iPS移植入55只鼠腦后,有46只形成畸胎瘤,發(fā)病率為83.6%;來自鼠肝細(xì)胞的7個(gè)iPS移植入36只鼠腦后,有13只死亡,其中 10只形成畸胎瘤,發(fā)病率為27.8%;而來自鼠胃上皮細(xì)胞的2個(gè)iPS移植入8只鼠腦內(nèi),沒有觀察到畸胎瘤。

上述數(shù)據(jù)顯示,由不同成體細(xì)胞衍生的iPS,生成的次級(jí)神經(jīng)球在形成畸胎瘤的危險(xiǎn)性上存在很大差異。因此,選擇何種體細(xì)胞來誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS,是未來細(xì)胞治療面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一。同時(shí),這項(xiàng)研究也驗(yàn)證了Yamanaka[17]的隨機(jī)模型認(rèn)為的,大部分乃至全部的分化細(xì)胞在導(dǎo)入4TFs后都有誘導(dǎo)為iPS的潛力。此外,研究還認(rèn)為c-myc逆轉(zhuǎn)錄病毒的使用并不影響次級(jí)神經(jīng)球畸胎瘤的形成傾向,而且也沒有檢測到c-myc或其他轉(zhuǎn)錄因子在iPS或次級(jí)神經(jīng)球內(nèi)的復(fù)活,但對(duì)于不同畸胎瘤形成傾向的潛在機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

3 高效誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS的可能機(jī)制

可能由于外源因子使得組織干細(xì)胞變形、病毒整合入特定的基因組位點(diǎn)以及插入的拷貝數(shù)不確定等緣故,Yamanaka研究小組及以前的誘導(dǎo)iPS的研究成功率只有0.067%[1]。但隨著研究的深入,基因路徑阻斷劑、化學(xué)小分子抑制劑等的應(yīng)用,在加速誘導(dǎo)進(jìn)程、提高效率等方面發(fā)揮了重要作用。

Hong等[18]在抑制p53和缺乏逆轉(zhuǎn)錄病毒c-myc的條件下,轉(zhuǎn)染鼠胚胎成纖維細(xì)胞,經(jīng)Nanog-GFP報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行易感性和特異性鑒定,證實(shí)為iPS,轉(zhuǎn)化率提高了10%。同時(shí)證實(shí)在p53缺失背景下,可以將終末分化的T淋巴細(xì)胞去分化重編程為iPS。他們利用DNA微陣列技術(shù)(microarray),分析人和鼠的成纖維細(xì)胞中均受p53調(diào)節(jié)的34個(gè)共有基因,證明p53可以抑制細(xì)胞癌變。Aparicio和Eaves[19]則認(rèn)為p53途徑在正常組織體內(nèi)平衡和腫瘤形成的調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。這在一定程度上說明,上述途徑雖然提高了轉(zhuǎn)化率,但也增加了新形成的iPS致癌風(fēng)險(xiǎn)。Marioán等[20]認(rèn)為 p53介導(dǎo)的DNA損傷響應(yīng)限制了重編程,從而確保了新形成的iPS基因組的完整性。在敲除p53的情況下,提高轉(zhuǎn)化率的同時(shí),卻面臨著DNA損傷,并長期伴隨著iPS形成異常以及染色體異常等風(fēng)險(xiǎn)。因此,p53對(duì)預(yù)防來自欠佳的親本細(xì)胞的iPSDNA損傷具有重要作用。而且,只有當(dāng)誘導(dǎo)DNA損傷的重組因子被引進(jìn)后,p53途徑才會(huì)被激活,因此,避開DNA損傷的細(xì)胞不可能開啟p53途徑,而效率低的原因可能與被編程細(xì)胞的DNA損傷有密切關(guān)系。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),由于端?？s短導(dǎo)致的DNA損傷增強(qiáng)的鼠成纖維細(xì)胞(G3 Terc2/2 M EFs)不能被誘導(dǎo)為iPS,盡管這些野生型細(xì)胞擁有正常的增殖速率和被癌基因轉(zhuǎn)染的能力,故而推測諸如縮短的端粒等可能是阻礙DNA損傷的野生型細(xì)胞被重編程的主要障礙。為了證實(shí)p53與DNA損傷的野生型細(xì)胞增殖的密切關(guān)系,在p53存在與缺失的情況下,利用Oct4、Klf4和Sox2重編程端?？s短了的野生型細(xì)胞來檢測p53的作用,經(jīng)過反復(fù)誘導(dǎo)和比照,發(fā)現(xiàn)p53可能是通過限制翻譯,來阻礙誘導(dǎo)鼠和人DNA損傷的野生型細(xì)胞形成iPS,并通過p53依賴的細(xì)胞凋亡機(jī)制清除這些細(xì)胞,而且這種效應(yīng)在功能失調(diào)的端?；蛲庠葱愿弑壤鼶NA損傷的野生型細(xì)胞將會(huì)惡化。數(shù)據(jù)顯示在這個(gè)過程中,p53對(duì)DNA損傷是致敏的,而且p53是通過介導(dǎo)多潛能性誘導(dǎo)階段的欠佳細(xì)胞的凋亡來限制重編程的,因此,可以認(rèn)為p53在重編程和轉(zhuǎn)化這兩個(gè)過程中,對(duì)損傷細(xì)胞都發(fā)揮著重要的控制作用。但是,持久抑制p53會(huì)增強(qiáng)基因組的不穩(wěn)定性,因而會(huì)影響iPS的生成[21]。

Li等[22]證實(shí)INK4/ARF基因座的激活是iPS誘導(dǎo)過程中限制速率的又一障礙。通常情況下,INK4/ARF基因座是處于靜默狀態(tài)的,在誘導(dǎo)過程中被激活。研究證實(shí),抑制INK4/ARF基因座的活性,對(duì)iPS誘導(dǎo)效率產(chǎn)生極大地正面效應(yīng),而同時(shí)抑制 p53和 INK4/ARF基因座的活性,則增強(qiáng)了細(xì)胞的自我更新能力,從而使體細(xì)胞的重編程變得容易[23]。

Lin等[24]利用 ALK5抑制劑SB431542和M EK抑制劑PD0325901提供的化學(xué)平臺(tái),將誘導(dǎo)效率提高到常規(guī)方法的100多倍。常規(guī)方法用未經(jīng)處理的、編碼4TFs的cDNAs轉(zhuǎn)染后,形成若干顆粒狀克隆,暗示其只是不完全的重編程克隆;在只有SB431542的情況下,同樣觀察到顆粒狀克隆,數(shù)目比人ESc樣克隆多幾倍;而在SB431542和PD0325901組合使用的情況下,顆粒狀克隆大大減少,人ESc樣克隆卻伴發(fā)性增加,說明此兩種抑制劑的組合可引導(dǎo)不完全重編程克隆狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆闹鼐幊炭寺顟B(tài),從此推進(jìn)整個(gè)重編程進(jìn)程。此外,經(jīng)此兩種抑制劑處理過的cDNAs,7 d即可誘導(dǎo)出iPS,大大加速了重編程的動(dòng)力學(xué)進(jìn)程。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn),一種小分子Thiazovivin與SB431542和PD0325901混合后,能大大提高iPS分離后的存活率,獲得更多的重編程克隆。為了檢測Thiazovivin在高效分離的同時(shí)是否對(duì)SB431542和PD0325901組合產(chǎn)生促進(jìn)作用,利用三者混合物再次誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)效率提高了近200倍,并縮短了轉(zhuǎn)化周期。

上述新方法的獨(dú)特之處在于調(diào)整了上游的信號(hào)途徑,而且能快速改進(jìn)普通細(xì)胞類型的重編程,能夠?yàn)榉遣《?、非DNA依賴的更高效率和更安全的重編程進(jìn)程提供基礎(chǔ)性平臺(tái),從而為各種各樣的應(yīng)用提供極其安全的人iPS。如果將前述的小分子抑制劑[24]和恰當(dāng)?shù)墓w細(xì)胞類型策略[16]結(jié)合起來,效果可能會(huì)更上一層樓。

此外,蛋白質(zhì)合成阻礙劑valproic acid(VPA)[25]、低氧環(huán)境[26]以及維生素C[27]同樣可以提高iPS的誘導(dǎo)效率,此方面的研究還在深入,前景誘人。

4 小 結(jié)

目前關(guān)于iPS的研究正如火如荼的進(jìn)行著,在iPS誘導(dǎo)的原料、效率、安全性等方面都取得了可喜的進(jìn)展。此外,在iPS的全能性、臨床應(yīng)用等方面也收獲甚大。通過四倍體囊胚注射方法證實(shí)iPS全能性的小鼠已經(jīng)誕生,還有誘導(dǎo)產(chǎn)生患者特異性iPS的報(bào)道,在原材料的獲取、移植免疫排斥、干細(xì)胞研究,退行性或損傷性疾病等方面優(yōu)勢顯著。但總體而言,誘導(dǎo)的效率還有待提高,安全性還需改進(jìn),遺傳學(xué)的穩(wěn)定性及后續(xù)變化證據(jù)尚顯不足,誘導(dǎo)極具多潛能性的耕作動(dòng)物細(xì)胞(如牛、馬等)的研究才剛起步(已經(jīng)培養(yǎng)出豬源iPS系),重編程的分子調(diào)控機(jī)制目前還不是很清楚,因此,iPS應(yīng)用于臨床實(shí)踐還為時(shí)尚早。但相信,隨著研究的深入,iPS所具有的優(yōu)勢在自體細(xì)胞替代治療、再生醫(yī)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、藥物開發(fā)、疾病模型等方面的臨床應(yīng)用前景是廣闊的,必將給相關(guān)疾病的患者帶來福音。

[1]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663.

[2]Yu JY,Vodyanik M A,Smuga-Otto K,et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells[J].Science,2007,318:1917.

[3]Zhou Q,Brown J,Kanarek A,et al.In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to β-cells[J].Nature,2008,455:627.

[4]Huangfu D,Osafune K,Maehr R,et al.Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2[J].Nature Biotechnol,2008,26(11):1269.

[5]Kim JB,Greber B,Marcos J,et al.Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4[J].Nature,2009,461:649.

[6]Kim JB,Sebastiano V,Wu G,et al.Oct4-Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells[J]Cell,2009,136(3):411.

[7]Babaie Y,Herwig R,Greber B,et al.Analysis of Oct4-dependent transcriptional networks regulating self-renewal and pluripotency in human embryonic stem cells[J]Stem Cells,2007,25(2):500.

[8]Kim JB,Zaehres H,Wu G,et al.Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells byreprogramming with two factors[J].Nature,2008,454:646.

[9]Kaji K,Norrby K,Paca A,et al.Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors[J].Nature,2009,458:771.

[10]Soldner F,Hockemeyer D,Beard C,et al.Parkinson′s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors[J].Cell,2009,136:964.

[11]Woltjen K,Michael IP,Mohseni P,et al.piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells[J].Nature,2009,458:766.

[12]Okita K,Hyenjong H,Takahashi K,et al.Generation of mouse-induced pluripotent stem cells with plasmid vectors[J].Nature protoc,2010(5):418.

[13]Okita K,Nakagawa M,Hyenjong H,et al.Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors[J].Science,2008,322(5903):949.

[14]Jia FJ,Wilson KD,Sun N,et al.a nonviral minicircle vector for deriving human iPs cells[J].Nature methods,2010,7(3):197.

[15]Yu JY,Hu KJ,Smuga-Otto K,et al.Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences[J].Science,2009,324:797.

[16]Miura K,Okada Y,Takashi A,et al.Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines[J].Nature Biotechnol,2009,27(8):743.

[17]Yamanaka S.Elite and stochastic models for induced pluripotent stem cell generation[J].Nature,2009,460(7251):49.

[18]Hong HJ,Takahashi K,Ichisaka T,et al.Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway[J].Nature,2009,460:1132.

[19]Aparicio S,Eaves CJ.p53:a new kingpin in the stem cell arena[J].Cell,2009,138:1060.

[20]Marioán RM,Strati K,Li H,et al.A p53-mediated DNA damage response limits reprogramming to ensure iPS cell genomic integrity[J].Nature,2009,460:1149.

[21]Liu Y,Elf SE,Miyata Y,et al.p53 regulates hematopoietic stem cell quiescence[J].Cell Stem Cell,2009,4:37.

[22]Li H,Collado M,Villasante A,et al.The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming[J].Nature,2009,460:1136.

[23]Utikal J,Polo JM,Stadtfeld M,et al.Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells[J].Nature,2009,460:1145.

[24]Lin TX,Ambasudhan R,Yuan X,et al.A chemical platform for improved induction of human iPscs[J].Nature Methods,2009,6(11):805.

[25]Huangfu D,Maehr R,Guo WJ,et al.Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds[J].Nature Biotechnol,2008,26(7):795.

[26]Yoshida Y,Takahashi K,Okita K,et al.Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent[J].Cell Stem Cell,2009,5:237.

[27]Esteban MA,Wang T,Qin BM,et al.Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells[J].Cell Stem Cell,2010,6:71.