王 艷，甄生航，鄭 軍，馬 霄，劉成桂，朱 洋，謝國(guó)明

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016)

0 引言

近年來(lái)，由于納米金(GNPs)除了具備納米材料共有的比表面積大、表面反應(yīng)活性高、有宏觀量子隧道效應(yīng)等良好催化性質(zhì)外，還具有獨(dú)特的親水性和生物相容性，因而，被廣泛用于生物傳感器的制備［3，4］。本研究采用將電化學(xué)分析的靈敏性和免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合的免疫傳感技術(shù)［5］及有放大電流效應(yīng)的納米金技術(shù)，利用層層自組裝將電子介體硫堇和sIgA抗體連接到電極表面，構(gòu)建了一種新型的唾液sIgA電流型納米免疫傳感器，并初步應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)。這為建立一種快速、簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)唾液sIgA檢測(cè)新方法奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 納米金的制備

采用鞣酸—檸檬酸鈉還原法制備［6］，自然冷卻后存于棕色瓶中備用，所得金溶膠為酒紅色，用透射電子顯微鏡表征，其平均直徑約為20 nm。

1.2 納米免疫傳感器的制備

1.2.1 Nafion—硫堇—納米金修飾玻碳電極的制備

玻碳電極經(jīng)0.3μm的Al2O3粉末拋光成鏡面，在蒸餾水、無(wú)水乙醇、蒸餾水中各超聲洗滌10 min，洗凈晾干待用。將5%的Nafion溶液用無(wú)水乙醇稀釋到1%，取10μL滴到預(yù)處理后的電極表面，室溫晾干成膜，然后，浸入含3 mmol/L 的硫堇醋酸緩沖溶液(Hac-NaAc，0.1 mol/L，pH=6.0)中在－0.4～0.1 V的電壓范圍內(nèi)進(jìn)行CV掃描，掃描速度為50 mV/s，持續(xù)掃描至得到穩(wěn)定的CV圖，再浸入0.5 mL納米金—?dú)ぞ厶腔旌先芤? h。然后，依次重復(fù)吸附硫堇和納米金，至達(dá)到飽和狀態(tài)。

1.2.2 唾液sIgA免疫傳感器的制備

將電極置于唾液sIgA抗體中4℃下浸泡過夜，最后將電極浸入0.25%HRP溶液2 h，以封閉電極上的非特異吸附位點(diǎn)，制備好的電極懸于醋酸緩沖溶液上方，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 納米免疫傳感器對(duì)唾液sIgA的檢測(cè)

用循環(huán)伏安法和計(jì)時(shí)安培法檢測(cè)，采用三電極系統(tǒng)，Nafion/{Thi/GNPs-CHIT}n/anti-sIgA/HRP(n為自組裝層數(shù))修飾的GCE為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極作為參比電極。在被檢標(biāo)本中孵育8 min后，再在25mL含26 mmol/L H2O2的醋酸緩沖液(pH=6.0)中進(jìn)行CV檢測(cè)，其響應(yīng)電流隨標(biāo)本中sIgA濃度的增加而不斷減小。標(biāo)準(zhǔn)曲線中每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)量3次，求電流均值，唾液sIgA濃度大于300 mg/L時(shí)，需稀釋后檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 傳感器電極表面層層自組裝納米金顆粒

圖1為納米金層層自組裝和sIgA抗體的固定過程。實(shí)驗(yàn)中，利用膠體金與硫堇存在強(qiáng)的S—金屬配位鍵作用，反復(fù)吸附實(shí)現(xiàn)了層層自組裝使比表面積急劇增大，極大地提高了傳感器中抗體的固定量，從而提高檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)下限。

師：同學(xué)舉例說到生活中有各種各樣的長(zhǎng)方體形狀的物體，那么請(qǐng)同學(xué)們不用眼睛看，從學(xué)具袋中，摸出一個(gè)長(zhǎng)方體的模型并觀察你手中的長(zhǎng)方體，說說你對(duì)長(zhǎng)方體有什么認(rèn)識(shí)？

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)用透射電子顯微鏡對(duì)電極修飾進(jìn)行了表征(見圖2)，由TEM圖可見，與(a)圖相比，(b)圖加入殼聚糖溶液后納米金顆粒分散更均勻。

2.2 唾液sIgA免疫傳感器電極的電化學(xué)性能

如圖3所示，用循環(huán)伏安法研究了制備過程中不同修飾電極的電化學(xué)特性。在圖3(a)中，曲線a由于體系中缺少電子媒介體，Nafion膜修飾的玻碳電極在醋酸緩沖液中只有平坦的CV圖。曲線b為電極修飾一次硫堇和納米金，可觀察到一對(duì)硫堇的氧化還原峰，說明進(jìn)入膜內(nèi)的硫堇可以有效地傳遞電子［7］。曲線c為修飾3層硫堇和納米金后，電極的峰電流進(jìn)一步增大。曲線d是修飾電極吸附sI-gA抗體后，峰電流有所下降，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子的空間位阻效應(yīng)，阻礙了電子的傳遞。最后，用HRP封閉電極上的非特異吸附位點(diǎn)，與曲線d相比曲線e峰電流值有所下降，表明HRP已成功吸附到電極表面。

圖1 唾液sIgA免疫傳感器制作流程圖Fig 1 Flow chart of salivary sIgA immunosensor fabrication

圖2 納米金與殼聚糖混合溶液的透射電鏡圖Fig 2 TEM image of GNPs-CHIT

圖3 修飾電極的電化學(xué)特性Fig 3 Electrochemistry characteristic of modified electrodes

圖3(b)是免疫傳感器在不同掃描速度下的CV圖。由圖可知，隨掃描速度從20～120 mV/s變化，固定在Nafion膜中的硫堇峰形可逆性好，氧化峰電流ipa和還原峰電流ipc不斷增加，ipa/ipc約為1，ipa和 ipc與掃描速度的平方根 v1/2/(mV·s－1)1/2成正比，線性方程為ipa=4.858 13v1/2+0.110024R=0.99644;ipc=－4.862 73v1/2－0.114244 R=－0.99534，表現(xiàn)出明顯的擴(kuò)散電流特征;峰位置基本不變，氧化峰電位和還原峰電位之差為80mV，表明膜中的硫堇能很好地傳遞電子。因此，抗體修飾膜的存在不影響介體的電化學(xué)性質(zhì)。

2.3 HRP的電化學(xué)催化特性

圖4為該傳感器加入H2O2前后的循環(huán)伏安圖。曲線a為加入H2O2之前CV圖呈現(xiàn)對(duì)稱的氧化還原峰。加入26 mmol/L的底物之后，還原峰增加，氧化峰減低(曲線b)，說明HRP成功地吸附到電極表面后仍保持催化活性。曲線c是該傳感器與100 mg/L sIgA標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生免疫反應(yīng)，在含有26 mmol/L底物的緩沖液中得到的CV圖，可見峰電流值明顯降低，說明固定在電極表面的anti-sIgA與sIgA標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生了免疫反應(yīng)，由于抗原抗體復(fù)合物的空間位阻作用，降低了HRP的催化活性，阻礙了電極表面與底物溶液間的電子傳遞。以上結(jié)果說明用HRP封閉電極上的非特異吸附位點(diǎn)簡(jiǎn)單可行。

圖4 免疫傳感器對(duì)H 2 O2的循環(huán)伏安響應(yīng)曲線Fig 4 Cyclic voltammetric response curves of immunosensor vs H2 O2

2.4 免疫傳感器的響應(yīng)特性

2.4.1 抗體工作濃度與底物濃度的確定

為了探討LBL法固定抗體的最適工作濃度，把1 g/L的抗體稀釋成不同濃度，觀察抗體濃度與抗體固定量的關(guān)系。結(jié)果表明抗體的固定量隨濃度的增加而增大，在抗體濃度達(dá)到1g/L時(shí)固定量最大，因此，抗體工作濃度選擇1g/L。

采用計(jì)時(shí)電流法對(duì)H2O2的濃度對(duì)電極的響應(yīng)性能的影響做了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:生物傳感器在1.0～26.0 mmol/L之間響應(yīng)電流線性升高。大于26.0 mmol/L時(shí)響應(yīng)電流開始下降，說明在此范圍內(nèi)固定在電極上的HRP具有強(qiáng)的催化活性。因此，實(shí)驗(yàn)中底物量為26 mmol/L。

2.4.2 pH和溫度對(duì)免疫傳感器的影響

pH影響抗體和酶的活性和穩(wěn)定性，因此，緩沖液的pH值對(duì)傳感器的性能影響很大。選擇醋酸緩沖溶液，在pH為4.5～7.5范圍內(nèi)考察了對(duì)催化性能的影響。相同條件下pH為6.0時(shí)，傳感器的響應(yīng)電流最大。因此，采用醋酸緩沖液(0.1 mol/L，pH=6.0)作為測(cè)定反應(yīng)液。

溫度對(duì)免疫反應(yīng)速率影響很大，在低于最適溫度時(shí)，溫度升高反應(yīng)速度加快;而高于最適溫度時(shí)，溫度升高反應(yīng)速度反而減慢，甚至發(fā)生蛋白的變性。實(shí)驗(yàn)表明:當(dāng)溫度在(37±1)℃，該傳感器抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間最短，而且，響應(yīng)電流最大。因此，實(shí)驗(yàn)測(cè)試溫度為37℃。

2.4.3 抗原抗體反應(yīng)時(shí)間對(duì)傳感器的影響

將該電極與100 mg/L的sIgA標(biāo)準(zhǔn)品在室溫下依次孵育 2，5，8，10，12，15，18，20 min 后，在25 mL 含有底物—醋酸緩沖液中進(jìn)行CV檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在開始的8 min內(nèi)響應(yīng)電流逐漸降低，8 min后電流趨于穩(wěn)定，表明電極基本飽和。因此，選擇8 min為孵育時(shí)間。

2.5 生物傳感器的檢測(cè)范圍、檢出限、響應(yīng)時(shí)間

如圖4該傳感器在－0.4～0.1 V范圍進(jìn)行CV掃描時(shí)，在－0.21 V處ipc最大，因此，工作電位定為－0.21 V。圖5為該傳感器對(duì)不同濃度sIgA響應(yīng)的計(jì)時(shí)電流圖。從圖中可知，傳感器響應(yīng)速度快，達(dá)到95%穩(wěn)態(tài)響應(yīng)時(shí)間不超過20 s。插圖為傳感器檢測(cè)sIgA所得結(jié)果的擬合曲線。由圖可知，傳感器的響應(yīng)電流與sIgA在6.5～300 mg/L之間呈良好的線性關(guān)系。電流與sIgA濃度(C)遵循以下關(guān)系:i(μA)=8.69093+0.08433C(mg/L)，相關(guān)系數(shù) R 為0.99233。檢出限為3.0 mg/L，表明傳感器有較好的檢測(cè)靈敏度。

圖5 生物傳感器對(duì)sIgA響應(yīng)的計(jì)時(shí)電流圖Fig 5 Chronoamperometric current response curves of biosensor vs sIgA

2.6 干擾實(shí)驗(yàn)

用該免疫傳感器檢測(cè)唾液中高豐度蛋白IgG，IgM，α—淀粉酶、白蛋白等，將這幾種干擾物分別加入到100 mg/L的sIgA標(biāo)準(zhǔn)溶液中，與加入前比較。結(jié)果表明:兩者響應(yīng)電流基本無(wú)變化。說明該傳感器可以有效消除假陽(yáng)性。

2.7 生物傳感器的重復(fù)性、穩(wěn)定性、再生性

用購(gòu)于Abcam公司的sIgA標(biāo)準(zhǔn)品作為高值檢測(cè)樣本，用生理鹽水(8.5 g/L，0.9%)稀釋50倍作為低值標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)測(cè)量20次，高值、低值的批內(nèi) CV分別為2.76%，3.13%;每天上午和下午各測(cè)一次，連續(xù)10 d，得到的批間CV分別為3.57%，4.39%。該傳感器不用時(shí)，洗凈晾干，懸于醋酸緩沖液上方4℃保存，每隔5 d對(duì)同一電極在相同條件進(jìn)行測(cè)量，經(jīng)過6次測(cè)量響應(yīng)電流下降為初始的86.7%。用過的傳感器用0.1 mol/L甘氨酸再生，甘氨酸能使抗原抗體復(fù)合物解離，解離后的抗原或抗體分子仍保持原來(lái)的理化特性和生物學(xué)活性。但結(jié)果顯示，再生的電極響應(yīng)電流有下降趨勢(shì)，再生7次后響應(yīng)電流下降為開始的75%左右。以上結(jié)果表明該傳感器具有較好的重復(fù)性、穩(wěn)定性和再生性。

2.8 初步臨床應(yīng)用

利用該傳感器檢測(cè)了30例臨床唾液標(biāo)本，取受試人員自然流出唾液1.0 mL，用生理鹽水稀釋100倍，每例待檢稀釋樣品取1.0 mL加入24.0 mL底物—醋酸緩沖液中檢測(cè)，準(zhǔn)確反應(yīng)8 min。同時(shí)，采用ELISA方法進(jìn)行平行檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)線性相關(guān)分析后得散點(diǎn)圖(圖6)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:本法檢測(cè)結(jié)果與ELISA法具有良好的相關(guān)性(R=0.98932，P＜0.001)。

圖6 免疫傳感器方法與ELISA法相關(guān)性分析散點(diǎn)圖Fig 6 Scatterplot of correlation analysis on methods of immunosensor and ELISA

3 結(jié)論

本研究利用LBL技術(shù)將硫堇和納米金修飾在電極表面，并成功地固定了唾液sIgA抗體，制備了一種新型的唾液sIgA電流型納米免疫傳感器，該傳感器制作簡(jiǎn)單，性能穩(wěn)定，能夠?qū)ν僖簊IgA進(jìn)行快速、準(zhǔn)確和特異的定量測(cè)定，有望在臨床推廣應(yīng)用。

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