胡寶慶，劉 毅，文春根,*

（1. 南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031；2. 江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022）

翹嘴鱖NADPH氧化酶三個調(diào)節(jié)亞基cDNA的克隆及表達特征

胡寶慶1，劉 毅2，文春根1,*

（1.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌330031；2.江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌330022）

吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶能生成用于清除病原微生物的活性氧簇 (reactive oxygen species, ROS)，在機體的防御體系中起著非常重要的作用。該文利用RT-PCR結(jié)合RACE-PCR的方法，對翹嘴鱖 (Siniperca chuatsi) NADPH氧化酶的3個調(diào)節(jié)亞基p40phox、p47phox和p67phox的cDNA進行了克隆。結(jié)果顯示p40phox基因cDNA序列全長為1 406 nt，開放閱讀框長度為1 050 nt，翻譯成349個氨基酸；p47phox 基因cDNA序列全長為1 686 nt，開放閱讀框為1 209 nt，翻譯成402個氨基酸；p67phox基因cDNA序列全長為2 185 nt，開放閱讀框長度為1 488 nt，翻譯成495個氨基酸。半定量PCR分析顯示在翹嘴鱖血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、腎、肝、脾、胸腺組織中都能檢測到這3個亞基的mRNA表達，然而，它們在不同組織中的表達強度具有差異。經(jīng)柱狀黃桿菌滅活苗FKG4免疫后，p40phox亞基mRNA在翹嘴鱖血液和頭腎中的表達量顯著上升，p47phox在頭腎和脾臟中的表達量顯著上升，而p67phox在血液、頭腎和脾臟中的表達量均顯著上升。由此推斷NADPH氧化酶參與了翹嘴鱖機體的抗菌免疫應(yīng)答。

翹嘴鱖；NADPH氧化酶；分子克?。恢鶢铧S桿菌

NADPH氧化酶主要存在于中性粒細(xì)胞及其它吞噬細(xì)胞的細(xì)胞膜上，能夠產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，具有殺菌作用，并參與宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答(Babior, 1999)。它由位于細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多種蛋白成分組成。細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶成分是異源二聚體跨膜蛋白，稱為細(xì)胞色素b558，由gp91phox和p22phox兩個催化亞基組成(Nauseef, 2004)。細(xì)胞質(zhì)中的成分包括p40phox，p47phox，p67phox亞基及一個小分子量GTP結(jié)合蛋白Rac，這些亞基對于酶的活化起著調(diào)節(jié)作用，吞噬細(xì)胞受到細(xì)胞因子、激素或病原微生物刺激時，它們會裝配到細(xì)胞色素b558上，形成具有完整生物活性的多酶復(fù)合體(Nauseef, 2004)。人(Homo sapiens) (Rooyer-Pokora et al, 1986; Volpp et al, 1989; Leto et al, 1990; Wientjes et al, 1993)、鼠(Mus musculus) (Bjorgvinsdottir et al, 1996; Jackson et al, 1994; Mizuki et al, 1998)、野牛(Bison bison) (Gauss et al, 2002)和海豚(Tursiops truncatus) (Inoue et al, 2000, 2001)細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中NADPH氧化酶的5個亞基均已被克隆和描述。

除Rac外，魚類NADPH氧化酶的5個亞基的cDNA也已從紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes) (Inoue et al, 2004)、鯉魚(Cyprinus carpio)(Mayumi et al, 2008)中克隆。此外，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和香魚(Plecoglossus altivelis)的這5個亞基的cDNA全序列以及大西洋鮭(Salmo salar)的gp91phox、p47phox、p67phox亞基的cDNA全序列。

翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)在我國分布廣泛，具有較高經(jīng)濟價值，享有“淡水石斑”之譽。柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)是引起淡水魚類爛鰓病發(fā)生的病原體。本文克隆了翹嘴鱖細(xì)胞質(zhì)中NADPH氧化酶的3個調(diào)節(jié)亞基基因cDNA全長，并利用滅活柱狀黃桿菌菌苗（FKG4）對鱖魚進行免疫，檢測這些亞基mRNA在鱖魚不同組織中的表達情況，以期為了解魚類呼吸爆發(fā)的機制及柱狀黃桿菌疫苗的免疫途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物處理、FKG4的制備及免疫注射

翹嘴鱖購自武漢市江夏區(qū)牛山湖漁場，為人工網(wǎng)箱養(yǎng)殖，實驗前，將購得的魚（450±50）g在實驗室自動充氣水循環(huán)系統(tǒng)中人工飼養(yǎng)14 d，水溫保持(25±1) °C，每日投喂小雜魚作為飼料，選取健康的魚作實驗用。

取25 ℃振蕩培養(yǎng)36 h的柱狀黃桿菌培養(yǎng)液100 mL，10 000g離心10 min，沉淀用無菌PBS (pH7.2) 清洗3次，用含1.0%福爾馬林的PBS重懸，室溫下滅活24 h，10 000g離心10 min，PBS清洗兩次，離心，用無菌PBS稀釋到約1.0×108cell s/mL，置于4 °C冰箱備用。

免疫注射前，將FKG4菌苗取出升溫至室溫，實驗魚用MS222溶液(1 mg/L)麻醉，分為2個組，每組6條，一組每尾魚經(jīng)胸鰭下注射0.1 mL的FKG4，另一組則每尾注射同等劑量的滅菌PBS作為對照組，然后繼續(xù)飼養(yǎng)7 d取樣。

1.2 主要試劑及菌株

Trizol試劑購自Invitrogen公司，Ex-Taq聚合酶，DL-2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，PMD-18T載體、pTA2載體均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自O(shè)mego公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。菌株F. columnare G4由中國科學(xué)院水生生物研究所提供，大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α由本實驗室保存。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)已報道的紅鰭東方豚和魟鱒的NADPH氧化酶p40phox、p47phox和p67phox亞基cDNA序列設(shè)計簡并引物，特異性引物根據(jù)擴增出來的中間片斷設(shè)計，所用引物均由上海華諾公司合成(表1)。

1.4 總RNA的提取和SMART cDNA的合成

分別取翹嘴鱖頭腎和脾臟混合，按Trizol試劑盒說明書介紹的方法提取組織的總RNA。 瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質(zhì)量。按照Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit方法進行第一鏈cDNA合成。具體操作按說明書進行。

1.5 各亞基中間片段及全長cDNA的擴增

根據(jù)表1所列引物，以第一鏈cDNA做為模板，先用簡并引物擴增出基因的cDNA片段，再根據(jù)各個基因?qū)?yīng)的特異性引物，用5′-RACE引物和SMART 5′錨定引物(5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3′)擴增基因的5′端，用3′-RACE引物和SMART 3′錨定引物(5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT30VN-3′)擴增基因的3′端。擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序后，拼接基因的5′端和3′端序列，獲得各基因的全長cDNA序列。

1.6 基因的氨基酸推測和序列比較分析

將測序所得到的cDNA序列用NCBI網(wǎng)站(http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTN、BLASTX和TBLASTX軟件進行同源基因的搜索，查找與其相關(guān)的同源序列；氨基酸序列的推斷和疏水性分析通過ExPASy網(wǎng)站上(http://www.expasy.org/)的軟件完成；氨基酸序列同源性比較由ClustalW1.8程序完成。 結(jié)構(gòu)域分析用SMART軟(http://smart.emblheidelberg.de)預(yù)測，按照MEGA 3.1中的鄰接法(neighbor-jointing method)構(gòu)建基于推導(dǎo)氨基酸的無根系統(tǒng)發(fā)生樹，樹的可靠性以1 000次bootstrap重復(fù)來評判。

1.7 組織表達與實時熒光PCR

利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測翹嘴鱖NADPH氧化酶各調(diào)節(jié)亞基在魚體組織中的表達。提取健康魚血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、腎、肝、脾、胸腺組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后將它們稀釋成相同的濃度，并以其為模板進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物的電泳條帶的亮度強弱指示各亞基基因表達的高低。

用實時熒光PCR方法定量分析翹嘴鱖NADPH氧化酶各調(diào)節(jié)亞基在經(jīng)FKG4免疫注射后的魚體組織中表達變化。免疫注射FKG4后7 d提取免疫組和對照組翹嘴鱖血液、鰓、頭腎、腸及胸腺和脾臟中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用Real-time PCR引物擴增各基因序列（表1），PCR產(chǎn)物用DNA膠純化試劑盒純化后克隆進入載體pTA2。質(zhì)粒DNA經(jīng)純化后用于制作標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，曲線的斜率應(yīng)在?3.6與?3.2之間，相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.96。cDNA質(zhì)粒溶液的濃度以O(shè)D260光密度值下進行測定，相應(yīng)的基因拷貝數(shù)按1 μg的1 000 bp DNA約等于9.1×109分子的公式進行換算(Overbergh et al, 2003)。定量實時熒光PCR在Chromo4 Real-Time (MJ Research)上進行；分別將翹嘴鱖NADPH氧化酶3個調(diào)節(jié)亞基在各組織中的基因拷貝數(shù)除以β-actin基因的拷貝數(shù)以得到均一化，所得比值用來進行統(tǒng)計分析，免疫組和對照組之間特異基因表達的差異用t-檢驗分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 翹嘴鱖NADPH氧化酶各調(diào)節(jié)亞基的cDNA全長及特征

翹嘴鱖NADPH氧化酶3個調(diào)節(jié)亞基cDNA的全長序列登錄號為DQ341372 (p40phox)、DQ341374 (p47phox)和DQ341373 (p67phox)。p40phox亞基cDNA序列全長為1 406 bp，開放閱讀框長度為1 050 bp，5′UTR長度為138 bp，3′UTR長度為218 bp包含mRNA不穩(wěn)定信號、加尾信號和poly(A)尾各1個。由cDNA序列推斷的蛋白包含349個氨基酸，預(yù)測相對分子質(zhì)量為40.4 k，理論pI為6.50。p47phox亞基cDNA序列全長為1 686 bp，開放閱讀框長度為1 209 bp，5′UTR長度為296 bp包含1個微衛(wèi)星序列(AC)，3′UTR長度為181 bp包括mRNA不穩(wěn)定信號、加尾信號、 poly(A)尾各1個。該cDNA序列編碼402個氨基酸，預(yù)測其相對分子質(zhì)量為46.2 k，理論pI為9.27。 p67phox亞基cDNA序列全長為2 185 bp，開放閱讀框長度為1 488 bp，5′UTR長度為59 bp，3′UTR長度為638 bp包括1個mRNA不穩(wěn)定信號、3個加尾信號和1個poly(A)尾。該cDNA序列翻譯成495個氨基酸，預(yù)測其分相對子質(zhì)量為55.4 k，理論pI為5.81。3個cDNA序列推斷的蛋白質(zhì)序列均無信號肽和跨膜區(qū)。

2.2 翹嘴鱖與其他動物的對應(yīng)調(diào)節(jié)亞基的氨基酸序列比對及進化樹分析

用BLAST程序?qū)βN嘴鱖NADPH氧化酶3個調(diào)節(jié)亞基基因編碼的蛋白質(zhì)進行同源性搜索（表2）。翹嘴鱖NADPH氧化酶的3個亞基與紅鰭東方豚和虹鱒的同源亞基的氨基酸序列同源性在65.9%～82.5%之間，而與人、鼠、野牛、海豚等哺乳動物的對應(yīng)亞基同源性在44.2%～55.8%之間。

運用ExPASy網(wǎng)站的軟件分析各亞基的結(jié)構(gòu)與功能域發(fā)現(xiàn)， 翹嘴鱖的p40phox蛋白含有PX 結(jié)構(gòu)域(His18-Thr138)、SH3結(jié)構(gòu)域(Pro172-Lys227)、PB1(Leu246-Ala339)結(jié)構(gòu)域各1 個。P47phox蛋白序列包括PX結(jié)構(gòu)域(Asn4-Arg121)和SH3結(jié)構(gòu)域(Glu200-Gly255) 各1個。p67phox蛋白包括3個TPR基序(motif) (Ser37-Leu70；Ala71-Asn104；Cys121-Ala154)、1個PB1結(jié)構(gòu)域(Gln347-Lys425)和2個SH3結(jié)構(gòu)域(Glu243-Glu298；Ile436-Pro491)。另外，通過CLUSTAL比對顯示這些亞基的結(jié)構(gòu)域與人、鼠、野牛、海豚等哺乳動物對應(yīng)的亞基蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)域和功能位點基本上匹配(圖1—3)，說明這些亞基的功能與哺乳動物對應(yīng)的亞基相似。

表 2 由翹嘴鱖p40phox、p47phox和p67phox亞基的cDNA推斷的氨基酸序列與其他動物對應(yīng)亞基氨基酸比較Tab. 2 Comparison of the amino acid homology among decuced amino acid sequences of p40phox, p47phox and p67phox subunit cDNA from Siniperca chuatsi and homologous genes from other species

圖 1 翹嘴鱖p40phox與其他脊椎動物p40phox之間的氨基酸序列比對Fig. 1 Alignment of p40phox amino acid sequences of Siniperca chuatsi with that of other vertebrates

圖 2 翹嘴鱖p47phox 與其他脊椎動物p47phox 之間的氨基酸序列比對Fig. 2 Alignment of p47phox amino acid sequences of Siniperca chuatsi with that of other vertebrates

對7種動物NADPH氧化酶3個調(diào)節(jié)亞基建立NJ系統(tǒng)樹(圖4a, b, c)，結(jié)果顯示魚類獨立于哺乳類動物之外，聚在同一枝上。翹嘴鱖NADPH氧化酶3個調(diào)節(jié)亞基在進化上與紅鰭東方鲀的親緣關(guān)系最近。

2.3 翹嘴鱖p40phox、p47phox和p67phox亞基組織表達及免疫刺激后的基因表達

翹嘴鱖NADPH氧化酶3個調(diào)節(jié)亞基在魚體血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、腎、肝、脾、胸腺組織中的基因表達強度不同(圖5)。在11種組織中都能檢測到各亞基的基因表達。p40phox在肝臟組織中表達最弱，在其他10種組織中表達都較強。p47phox在頭腎、鰓、心臟、脾組織中表達較強，在其余7種組織中的表達較弱；p67phox在頭腎、鰓、脾組織中表達較強，在血液、腦、性腺、心臟、腸、腎、胸腺組織中表達較弱，然而，在肝臟組織中幾乎檢測不到。

經(jīng)FKG4免疫后，翹嘴鱖3個調(diào)節(jié)亞基在血液、鰓、頭腎、腸、脾及胸腺組織中的表達也有差異(圖6)。在對照組鱖魚的頭腎中，3個亞基的表達量都很高。經(jīng)過免疫注射7d后，p40phox在鱖魚血液和頭腎組織中的表達顯著上升；p47phox在頭腎和脾組織中的表達顯著上升；p67phox在血液、頭腎和脾組織中的表達顯著上升；然而，3個調(diào)節(jié)亞基在鰓、腸及胸腺中的表達均無顯著地變化。

3 討 論

翹嘴鱖p40phox氨基酸序列長度比紅鰭東方鲀p40phox長1個氨基酸，比虹鱒p40phox短9個氨基酸，但比人、野牛、鼠、海豚等哺乳動物p40phox長10個氨基酸；p47phox的氨基酸序列長度比紅鰭東方鲀p47phox短21個氨基酸，比虹鱒p47phox短9個氨基酸，比人、野牛、鼠和海豚等哺乳動物p47phox分別長12、10、12和11個氨基酸；p67phox的氨基酸序列長度與紅鰭東方鲀p67phox相同，比虹鱒p67phox短9個氨基酸，比人、野牛、鼠、海豚等哺乳動物p67phox分別短21、22、20、21個氨基酸。雖然翹嘴鱖NADPH氧化酶的3個調(diào)節(jié)亞基p40phox、p47phox和p67phox的氨基酸序列與人、鼠、野牛及海豚的相應(yīng)亞基長度不一，且相似性較低，但是它們都有類似的結(jié)構(gòu)和功能域以及相互作用位點。人的p40phox和p47phox的PX結(jié)構(gòu)能有選擇地識別PtdIns(3)P和PtdInsP2，這有助于它們在活化后被錨定到細(xì)胞膜上，進而裝配成有活性的多酶復(fù)合體，Arg57、Arg58、Tyr59、Arg105殘基對于維持這一功能是必要的(Nauseef, 2004; Karathanassis et al, 2002)。這一結(jié)構(gòu)在翹嘴鱖以及其它動物內(nèi)都存在，并且這些位點均保守。人的p40phox的SH3結(jié)構(gòu)域能夠與p47phox的C端的PRR結(jié)構(gòu)相互作用，PC基序是與p67phox發(fā)生作用的部位 (Nauseef, 2004)。翹嘴鱖也像其他動物一樣均具有類似的結(jié)構(gòu)。人的p67phox的TPR結(jié)構(gòu)與Rac亞基相互作用(Nauseef, 2004)，這一結(jié)構(gòu)在其他動物中均存在。由此推斷翹嘴鱖與人的NADPH氧化酶亞基都擁有相似的活化機制。

哺乳動物p67phox亞基的脯氨酸富裕區(qū)(PRR)是與亞基p47phox相互作用的重要區(qū)域(Wientjes et al, 2003)，而魚類的該區(qū)域都不保守。由此推測在魚類的p67phox亞基與p47phox亞基的相互作用可能比哺乳動物弱。人的p47phox的PX結(jié)構(gòu)有兩個可區(qū)分的堿性區(qū)域，在空間結(jié)構(gòu)上呈兩個口袋狀，能識別磷脂酰肌醇，有助于p47phox在質(zhì)膜上的錨定；Arg43、Phe44和Arg90是第一個堿性袋必需的；Arg70、Lys55和 His51對第二個堿性袋的存在是必需的，兩個疏水性殘基Ile65與Trp80在結(jié)合時插入到質(zhì)膜或溶酶體膜上(Karathanassis et al, 2002; Stahelinet al, 2003)。雖然預(yù)測的翹嘴鱖p47phox蛋白的Ile65、Trp80殘基和Arg70、Lys55、His51很保守，但是Arg43、Phe44殘基分別被Thr 和Tyr殘基替代。因此，推測翹嘴鱖p47phox的PX結(jié)構(gòu)的第一個堿性袋可能不存在，表明p47phox結(jié)合到質(zhì)膜或溶酶體膜上的能力比哺乳動物要弱。過去認(rèn)為p47phox N端PX結(jié)構(gòu)域中的PXXP結(jié)構(gòu)域起著自動抑制的作用，它能與p47phox C端的SH3區(qū)域相互作用，掩蓋了磷脂酰肌醇結(jié)合位點，因而阻止了細(xì)胞質(zhì)亞基復(fù)合物與膜的結(jié)合(Hiroaki et al, 2001)。最近資料認(rèn)為p47phox的兩個SH3結(jié)構(gòu)能形成一個小溝，p47phox的堿性區(qū)域被掩蓋在這個小溝內(nèi)，在細(xì)胞靜息期，小溝中保守的Trp193和Trp263殘基與堿性區(qū)域的核心結(jié)構(gòu)(296～304殘基)相互作用，從而起到自動抑制作用，這2個SH3對于維持這種作用都是必需的(Groemping & Rittinger, 2005)。紅鰭東方鲀、虹鱒的p47phox像其他動物一樣，都包含2個SH3結(jié)構(gòu)域 (Inoue et al, 2004)，但是翹嘴鱖p47phox僅有1個SH3結(jié)構(gòu)，而且Trp193殘基缺失，因此推測翹嘴鱖堿性區(qū)域與SH3結(jié)構(gòu)域之間的相互作用可能不存在或很弱，它的分子間自動抑制作用可能是由PXXP與SH3區(qū)域相互作用造成。

圖 3 翹嘴鱖p67phox與其它脊椎動物p67phox之間的氨基酸序列比對Fig. 3 Alignment of p67phox amino acid sequences of Siniperca chuatsi with that of other vertebrates

圖 4 用7種動物p40phox(a)、p47phox(b)、p67phox(c)亞基氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹Fig. 4 Phylogenetic tree inferred from amino acid sequences of subunits of p40phox(a)，p47phox(b)，p67phox(c) from seven animals

圖 5 翹嘴鱖p40phox, p47phox, p67phox亞基在不同組織中的基因表達Fig. 5 Expression of Siniperca chuatsi p40phox, p47phox, p67phox transcripts in a variety of tissues

圖 6 翹嘴鱖p40phox (a)、p47phox (b)及p67phox (c)在免疫魚(■)與對照魚(□ ) 6種織中的表達Fig. 6 Expression of Siniperca chuatsi p40phox (a), p47phox (b) and p67phox (c) in 6 tissues of vaccinated (■) and control fish (□)

磷酸化作用被認(rèn)為是NADPH氧化酶活化過程中的一個關(guān)鍵的事件。大多數(shù)的亞基(除Rac和gp91phox)在活化過程中都顯示不同程度的磷酸化，人的p47phox有11處磷酸化位點，分別位于絲氨酸303、304、310、315、320、328、345、348、359、370和379（Groemping & Rittinger, 2005)。p40phox有2處磷酸化位點，位于Thr154 和Ser315(Groemping & Rittinger, 2005)，p67phox僅確定Thr233發(fā)生磷酸化(Groemping & Rittinger, 2005)。翹嘴鱖的這些亞基絕大多數(shù)磷酸化位點都很保守，然而，p40phox的Gly321代替了相應(yīng)位點的Ser315；p47phox的Ser345、Ser359分別被Ala、Lys代替；p67phox中Thr233被Glu233取代，由此表明翹嘴鱖NADPH氧化酶3個亞基的磷酸化作用比哺乳動物弱。

魚類脾臟的橢圓體、頭腎中的造血組織、心臟的圍心腔及血液等組織中含有較為豐富的吞噬細(xì)胞(Ellis, et al, 1976)。鰓、腸作為魚類主要的黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosa-associated lymphoid tissue)，也含有較為豐富的吞噬細(xì)胞 (McMillan et al, 1997; Lin et al, 1998)。這些吞噬細(xì)胞都能夠產(chǎn)生呼吸爆發(fā)(respiratory burst) (Lin et al, 1999; Clerton et al, 1998)。因此，翹嘴鱖的3個亞基的mRNA在頭腎、脾臟、血液中表達量較高，這與鯽魚和紅鰭東方鲀的表達模式是一致的(Inoue et al, 2004; Mayumi et al, 2008)。即使在同一組織中，三個亞基的mRNA表達量也有些差異，可能是由于各亞基基因的轉(zhuǎn)錄時間差異造成的。利用LPS體外刺激人或紅鰭東方鲀的粒細(xì)胞6～24 h后，NADPH氧化酶的各亞基中，均只有p47phox的mRNA表達顯著上升，其他亞基的mRNA表達無明顯變化(Inoue et al, 2004; Cassatella et al, 1991)。然而，用FKG4對翹嘴鱖進行免疫刺激后發(fā)現(xiàn)，不僅p47phox在頭腎、脾中的表達顯著上升，而且p40phox和p67phox在頭腎、脾和血液中的表達也顯著上升。這可能是由于活體免疫刺激了魚體的這些主要免疫器官，從而導(dǎo)致組織中粒細(xì)胞含量增多；在鰓、腸、胸腺中的表達變化不顯著，可能是由于這些組織在魚體免疫系統(tǒng)中處于次要地位。

致謝：本研究得到了中國科學(xué)院水生生物研究所聶品實驗室的幫助，在此表示感謝！

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cDNA Cloning and Expression Characterization of Three Regulatory Subunits of NADPH Oxidase Within Cytoplasm from Mandarin Fish,Siniperca chuatsi

HU Bao-Qing1, LIU Yi2, WEN Chun-Gen1,*

(1. College of Life Sciences, Nanchang University, Nanchang 330031, China;
2. College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

The phagocyte NADPH oxidase plays a crucial role in host defense against invading microorganisms by catalyzing the formation of reactive oxygen species, which is the precursor of a variety of microbicidal oxidants such as hydrogen peroxide (H2O2). In the present study, full-length cDNAs of three regulatory subunits of NADPH oxidase, including p40phox, p47phox, p67phox were cloned from head kidney of mandarin fish utilizing the reverse transcription polymerase chain reaction and rapid amplification of cDNA ends. Sequence analysis showed that the full length cDNA of p40phox is 1 406 nt, containing a 1 050 nt open reading frames that encodes a 349 amino acid protein, the full length cDNA of p47phox is 1 686 nt, containing a 1 209 nt open reading frames that encodes a 402 amino acid protein, the full length cDNA of p40phox is 2 185 nt, containing a 1 488 nt open reading frames that encodes a 495 amino acid protein. Semi-quantitative RT-PCR analyses from various tissues indicated that mRNAs of the three subunits can be detected in the blood, brain, heart, spleen, kidney and thymus, but their expression intensity are different in tissues. Stimulating the mandarin fish with formalin killedFlavobacterium columnareG4 significantly up-regulated the expression of p40phox in blood and head kidney; and p47phox in head kidney and spleen; and p67phox in blood, head kidney and spleen. The results suggested that mandarin NADPH oxidase was involved in the immune responses against bacteria.

Siniperca chuatsi; NADPH oxidase; Molecular cloning;Flavobacterium columnare

胡寶慶（1972-），男，江西波陽人，講師，主要從事水產(chǎn)動物疾病研究。E-mail：baoqinghu@sina.com

Q78; Q959.483； Q959.483.06

A

0254-5853-(2010)03-0250-11

10.3724/SP.J.1141.2010.03250

2009-09-14；接受日期：2009-12-21

國家自然科學(xué)基金資助項目(30960296)；江西省科技攻關(guān)項目（2004）

*通訊作者(Corresponding author)，文春根 （1963?），男，漢族，江西南昌人，教授，主要從事水產(chǎn)動物疾病方面的研究。E-mail: cgwen@ncu.edu.cn