陳偉，閆寧環(huán)，錢文濤，李洪亮，于景華,3

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.內(nèi)蒙古化工學(xué)院，呼和浩特 010018；3.天津科技大學(xué)，天津 300457）

添加牛奶堿性蛋白牛奶對大鼠骨密度的影響

陳偉1，閆寧環(huán)2，錢文濤1，李洪亮1，于景華1,3

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.內(nèi)蒙古化工學(xué)院，呼和浩特 010018；3.天津科技大學(xué)，天津 300457）

探討添加牛奶堿性蛋白（MBP）牛奶對正常大鼠骨密度的影響。將50只SD大鼠分為低鈣對照組、碳酸鈣、低、中、高5個劑量組。分別采用含鈣40，80，96 mg/kg及含3.3，6.7，8 mg牛奶堿性蛋白，檢測體質(zhì)量、骨密度、骨鈣以及鈣吸收率等指標(biāo)。結(jié)果表明，各劑量組對大鼠體質(zhì)量在3個月中未見顯著差異；各劑量組大鼠股骨干重、股骨遠(yuǎn)心端骨密度、股骨中點(diǎn)骨密度、骨鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯高于低鈣對照組；高劑量組的鈣表現(xiàn)吸收率明顯高于碳酸鈣對照組。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》推斷，添加牛奶堿性蛋白的牛奶產(chǎn)品對大鼠具有增加骨密度作用。

牛奶堿性蛋白；骨密度；功能

0 引 言

由于世界人口的老齡化，骨質(zhì)疏松發(fā)病率越來越高，并且女性多于男性，即使在發(fā)達(dá)國家也是常見的代謝性骨病。骨密度（BMD）指骨單位面積所含的骨礦物量，它是反映人體骨骼代謝狀況的一項重要指標(biāo)。研究表明骨組織的強(qiáng)度有75%～85%與骨密度（BMD）有關(guān)，隨著年齡的老化，周身各骨骼的骨密度均呈逐漸下降趨勢，股骨頸的BMD在20～90歲之間，女性要下降58%，男性要下降39%，BMD下降到一定程度，易于發(fā)生骨折。

牛乳堿性蛋白（Milk Basic Protein，MBP）從牛奶乳清中分離出來，是乳蛋白質(zhì)的堿性部分。MBP包含既可以影響骨形成又可以影響骨吸收的活性物質(zhì)，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞形成和調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞代謝的功能，并能夠維持骨重建的平衡，對預(yù)防骨質(zhì)疏松[1-6]。

本研究利用對大鼠的口服實(shí)驗(yàn)，研究含牛乳堿性蛋的牛奶對大鼠骨密度的作用，為其在人體的臨床使用提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 動物

出生4周斷乳SD大鼠，清潔級，雌性，64～75 g，50只。飼料室溫度為20～25℃，相對濕度為40%～70%，

1.2 牛奶堿性蛋白指標(biāo)工藝

全脂牛奶→離心分離→巴氏消毒（72℃）→冷卻小于10℃→陽離子交換吸附→NaCl洗脫→濃縮→冷凍干燥→研磨→包裝。

1.3 劑量設(shè)計

樣品為添加牛奶堿性蛋白的牛奶（牛奶堿性蛋白由新西蘭tatua公司提供），受試物成品的人體推薦量為每日500 mL（每60 kg體質(zhì)量），鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.093%，牛奶堿性蛋白量為40 mg/d。由于受試物成品的推薦量過大，故采用牛奶濃縮為奶粉（8倍濃縮）作為受試樣品，其人體推薦量為每日63 g（每60 kg體質(zhì)量），含鈣量為0.76%。本研究根據(jù)供試濃縮物的溶解性，配制成最大可灌胃溶液，即為人體推薦劑量的12倍，將此劑量設(shè)置為高劑量組（每千克體質(zhì)量為12.6 g和8 mg牛乳堿性蛋白），下設(shè)中、低劑量分別為人體推薦量的10倍和5倍，及10.5和5.3 g（每60 kg體質(zhì)量），相當(dāng)于受試物成品劑量為100，83.3，41.7 mL（每60 kg體質(zhì)量）。同時設(shè)立兩個對照組：低鈣對照組、碳酸鈣對照組0.24 g/60 kg（與高劑量組鈣水平相同，含鈣量為96 mg/60 kg）。

1.4 儀器設(shè)備

電子天平（PL3002）；電子秤（ACS-3A型）；原子吸收分光光度計（AA-300）；雙能X線骨密度儀（QDR-4000型）。

1.5 試劑

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氧化鑭溶液：稱取分析純氧化酶（純度大于99.99%）25g，加入75 mL優(yōu)級純鹽酸，加去離子水至1 000 mL。

鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取1.2486 g分析純碳酸鈣（純度大于99.99%），加入50 mL去離子水，加鹽酸使之溶解。移入1 000 mL容量瓶中，加2%的氧化鑭溶液至刻度。此溶液1.00 mL相當(dāng)于500 ug鈣。此溶液儲存于聚乙烯瓶中，4℃保存，臨用時稀釋。

2 方法與步驟

2.1 樣品處理

取供試濃縮物5.3 g、10.5 g、12.6 g，分別加去離子水至20 mL，充分溶解后，即為低、中、高3個劑量組供試液。稱取含鈣量為40%的碳酸鈣0.24 g，加去離子水至20 mL，混勻，即為碳酸鈣對照組供試液。

鈣吸收實(shí)驗(yàn)是根據(jù)本實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計要求及動物飼料攝入情況（每日約8 g/100 g），分別將供試濃縮物65.6，131.3，157.5 g摻入基礎(chǔ)飼料至1 kg，拌勻，經(jīng)飼料機(jī)制成飼料，即成低、中、高3種不同受試物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的飼料，分別給3組動物喂飼料，低鈣對照組給予基礎(chǔ)飼料：取含鈣量為40%的碳酸鈣2.99 g摻入基礎(chǔ)飼料1 kg拌勻，即成碳酸鈣對照組飼料。

2.2 給樣途徑

灌胃，灌胃容量為2 mL/100 g。鈣吸收實(shí)驗(yàn)給予3 d配制的飼料。

2.3 觀察指標(biāo)與方法

（1）體重及身長：灌胃給予樣品3個月，每周稱量并記錄各組動物體重。每周還要測量身長1次。

（2）鈣吸收實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)3周后將大鼠放入代謝籠，進(jìn)行3 d鈣代謝實(shí)驗(yàn)。記錄3 d進(jìn)食量，收集72 h糞便，測定飼料及糞便中鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

（3）股骨骨密度測定：解剖大鼠，剝離左側(cè)股骨，應(yīng)用QDR-4000型骨密度儀測定大鼠股骨中點(diǎn)及股骨遠(yuǎn)心端骨密度，將股骨烤干至恒重，稱量骨干重。

（4）骨鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用原子吸收法測量。

2.4 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計。

3 結(jié) 果

3.1 樣品對大鼠體重的影響

表1 為樣品對大鼠體重的影響。由表1可以看出，各組體重在喂養(yǎng)的3個月中均未見顯著性差異 （P＞0.05），受試物對大鼠體質(zhì)量變化沒有明顯影響。

表1 樣品對大鼠體質(zhì)量的影響

由表1可以看出，各組體質(zhì)量在喂養(yǎng)的3個月中均未見顯著性差異（P＞0.05），受試物對大鼠體質(zhì)量變化沒有明顯影響。

3.2 樣品對大鼠股的影響

表2 為樣品對大鼠股骨的質(zhì)量、骨鈣及骨密度的影響。由表2可見，低劑量組和中劑量組劑量組與低鈣對照組比較，大鼠股骨干重、股骨遠(yuǎn)心端骨密度、股骨中點(diǎn)骨密度、骨鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯高于低鈣對照組（P＜0.05）；高劑量組的股骨遠(yuǎn)心端骨密度、股骨中點(diǎn)骨密度及骨鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)與碳酸鈣對照組相比，均無顯著性差異（P＞0.05）。同樣鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的添加牛奶堿性蛋白與碳酸鈣組相比較，添加牛奶堿性蛋白的牛奶組在股骨干重、股骨遠(yuǎn)心端骨密度、股骨中點(diǎn)骨密度、骨鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)上的數(shù)字均要高于碳酸對照組。在骨鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)上，每千克體質(zhì)量為8 mg牛乳堿性蛋白（MBP）的劑量組與碳酸鈣對照組相比較骨鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為141 mg/g和147 mg/g。

表2 對大鼠股骨的質(zhì)量、骨鈣及骨密度的影響

3.3 樣品對大鼠鈣吸收的影響

比均無顯著性差異（P＞0.05），各劑量組的鈣表現(xiàn)吸收率要明顯高于低鈣對照組（P＞0.05），高劑量組的鈣表現(xiàn)吸收率明顯高于碳酸鈣對照組（P＜0.05）。毎千克體質(zhì)量為8 mg牛奶堿性蛋白的劑量組的鈣吸收率要明顯高于同等鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳酸鈣對照組，表明牛奶堿性蛋白對鈣的吸收有顯著的影響。中劑量組的鈣表吸收率為96.8%，與碳酸鈣對照組或低鈣對照組雖未統(tǒng)計學(xué)的差異，但絕對值的差異是比較大，同樣也表明牛奶堿性蛋白對鈣代謝有較大影響，該研究結(jié)果與研究結(jié)果一致。

表3 樣品對大鼠實(shí)驗(yàn)期內(nèi)鈣吸收的影響

4 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，牛奶堿性蛋白（MBP）包含既可以影響骨形成又可以影響骨吸收的活性物質(zhì)，具有促進(jìn)骨細(xì)胞形成和調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞代謝的功能，能夠維持骨重建的平衡，對預(yù)防骨質(zhì)疏松，改善骨質(zhì)健康具有積極意義[7]。同時，對牛奶堿性蛋白對正常大鼠的實(shí)驗(yàn)研究表明牛奶堿性蛋白對大鼠骨遠(yuǎn)心端骨密度和骨礦物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于對照組[8]。本研究是以國家保健食品規(guī)范的操作方式，采用不同的牛乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)，給正常大鼠灌胃90 d，觀察骨密度和骨礦質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，以為其在人群中應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。

本研究表明，各劑量組正常大鼠的體重與對照組未見顯著差別，說明添加牛奶堿性蛋白的牛奶對正常大鼠體重沒有影響。低劑量組和中劑量組劑量組與低鈣對照組比較，大鼠股骨干重、股骨遠(yuǎn)心端骨密度、股骨中點(diǎn)骨密度、骨鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯高于低鈣對照組（P＜0.05）；高劑量組的股骨遠(yuǎn)心端骨密度、股骨中點(diǎn)骨密度及骨鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)與碳酸鈣對照組相比，均無顯著性差異。高劑量組的鈣表現(xiàn)吸收率明顯高于碳酸鈣對照組（P＜0.05）。毎千克體質(zhì)量為8 mg牛奶堿性蛋白的劑量組的鈣吸收率要明顯高于同等鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳酸鈣對照組，表明牛奶堿性蛋白對鈣的吸收有顯著的影響。本研究的對照組為碳酸鈣，由于其具有較高的鈣吸收，因此，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒荒芎芎玫娘@示添加牛奶堿性蛋白對鈣的吸收作用。

本研究顯示，添加牛奶堿性蛋白的牛奶對大鼠具有增加骨密度功能。但牛奶是一個復(fù)雜的混合體，牛乳中復(fù)雜的成分帶來了對研究牛奶堿性蛋白對實(shí)驗(yàn)中鈣的吸收的難以辨認(rèn)因素。另外，牛奶堿性蛋白是促進(jìn)鈣的吸收，當(dāng)鈣已經(jīng)足夠充足的時候，可能就不易觀察牛奶堿性蛋白對鈣的保持作用。因此，可能對于缺乏鈣的動物模型是更為科學(xué)的考察牛奶堿性蛋白的增加骨密度功能。當(dāng)牛奶堿性蛋白劑量較低時，改善骨密度的功能可能是需要較長時間才能顯示其功能作用。對牛奶堿性蛋白在牛奶中對骨密度的功能作用有待于進(jìn)一步研究。

[1]YUKIHIRO T,KOBAYASHI N.Whey Protein Suppresses the Osteoclastmediated Bone Resorption and Osteoclast Cell Formation[J].Int Dairy Journal,1997,6（7）：821-825.

[2]YUKIHIRO T,YASUHIRO M.Milk Whey Protein Enhances the Bone Breaking Force in Ovariectomizedrats[J].Nutr Res.,1997,17（12）：1709-1720.

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[5]YASUHIRO M,ATSUSHI S.Cystatin C in Milk Basic Protein（MBP）andItsInhibitoryEffectonBoneResorptioninVitro[J].BiosciBiotechnol Biochem,2002,66（12）：2531-2536.

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[8]盧鈺，柴巍中，林曉明.乳堿性蛋白對大鼠骨密度的影響[J].衛(wèi)生研究，2007,36（1）：37-40.

[9]中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范[S].2003.

Effect of mik contain Milk Basic Protein on rat mineral density

CHEN Wei1，YAN Ning-huan2，QIAN Wen-tao1，LI Hong-liang1，YU Jing-hua1，3
（1.Inner Mongolia Mengniu Dairy Industry Co.Ltd.，Hohhot 011500，China；2.Inner Mongolia vocational college of chemical engineering，Hohhot 010018，China；3.Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Objective：To investigate the effect of milk contain milk basic protein（MBP）on bone mineral density（BMD）in normal rats.Methods：50 normal Sprague-Dawley rats were randomly separated into 5groups：the calcuim contain is 40、80、96 mg/kg respectivly（with 3.3，6.7，8 mg MBP were applied in each group）.Aoirdupois，bone mineral density，calcuim absorptivity were determined termly.Results：the Aoirdupois of rats have not notable varity of each sample group;the thighbone aoirdupois、thighbone density of far away of heart,thighbone density of medium heart,and cacuim contain were significantly higher than those in low contrlo group;the calcuim absorptivity were significantly higher than those in calcium carbonate contrlo group.Base on the correlative standard,we can get the conclussion that the mik with the addition of MBP can increase the bone mineral density of the rats.

Milk Basic Protein；bone mineral density；functional

TS252.1

A

1001-2230（2011）07-0015-03

2011-05-31

陳偉（1980-），男，碩士，從事乳及乳制品加工工藝研究工作。