孫愛(ài)杰，孫本風(fēng)，趙純潔

（黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，a檢測(cè)中心；b.研發(fā)中心（北京）；黑龍江 齊齊哈爾 161006）

紫外線(xiàn)對(duì)枯草芽孢桿菌的誘變效應(yīng)研究

孫愛(ài)杰a，孫本風(fēng)b，趙純潔a

（黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，a檢測(cè)中心；b.研發(fā)中心（北京）；黑龍江 齊齊哈爾 161006）

枯草芽孢桿菌是一種無(wú)毒副作用、無(wú)殘留的綠色飼料添加劑，研究表明，可以利用枯草芽孢桿菌進(jìn)行生物防治或生產(chǎn)微生物殺菌劑以替代劇毒化學(xué)藥品。利用紫外線(xiàn)對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行誘變，通過(guò)實(shí)驗(yàn)紫外線(xiàn)處理150 s時(shí)致死率幾乎為100%，120 s時(shí)誘變效果最好，對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最明顯。

枯草芽孢桿菌；紫外線(xiàn)；誘變

Kew words：Bacillus subtilis；ultraviolet radiation；mutagenic effects

0 引 言

近年來(lái)，枯草芽孢桿菌的研究和使用發(fā)展極為迅速。紫外線(xiàn)作為物理誘變因子用于工業(yè)菌種的誘變處理具有悠久的歷史。目前為止，對(duì)于經(jīng)誘變處理后得到的高單位抗生素產(chǎn)生菌中，有80%左右是通過(guò)紫外線(xiàn)誘變處理后經(jīng)篩選而獲得的[1]。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)了解一下紫外線(xiàn)對(duì)枯草芽孢桿菌的誘變效應(yīng)。

1 枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用

1.1 枯草芽孢桿菌的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特征

枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種。單個(gè)細(xì)胞（0.7～0.8）×（2～3）μm，著色均勻。 無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。 革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢（0.6～0.9）×（1.0～1.5）μm，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚?？莶菅挎邨U菌是一種無(wú)毒副作用、無(wú)殘留的綠色飼料添加劑。其產(chǎn)品中含有的活菌是以?xún)?nèi)生孢子的形式存在的，能耐酸、耐鹽、耐高溫及耐擠壓，在配合飼料制粒過(guò)程中以及通過(guò)酸性胃環(huán)境時(shí)比較穩(wěn)定?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌為“公認(rèn)安全（GRAS）”的細(xì)菌[2]。我國(guó)于1994年批準(zhǔn)使用的益生菌有6種，芽孢桿菌就是其中之一?！按倬焙汀罢{(diào)痢生”均是國(guó)內(nèi)較早研制成功的蠟樣芽孢桿菌微生態(tài)制劑[3]。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名[4]。通過(guò)分泌多種消化酶，芽孢桿菌能夠促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化；通過(guò)分泌維生素及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供動(dòng)物利用，可以促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)；通過(guò)抑制動(dòng)物體內(nèi)的有害菌，可以起到預(yù)防動(dòng)物疾病，優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境的作用[5]。

1.2 枯草芽孢桿菌的功能

生物奪氧；拮抗致病微生物，改善體內(nèi)外生態(tài)環(huán)境；增強(qiáng)動(dòng)物體的免疫功能；產(chǎn)生多種消化酶；產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。芽孢桿菌在動(dòng)物腸道內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，能產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如維生素、氨基酸、有機(jī)酸、促生長(zhǎng)因子等，參與動(dòng)物機(jī)體新陳代謝，為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6]。

1.3 紫外線(xiàn)的誘變作用

1.3.1 誘變的分類(lèi)

物理誘變、化學(xué)誘變、空間技術(shù)誘變、復(fù)合誘變等[7]。

1.3.2 紫外線(xiàn)的特性

太陽(yáng)光和人工光源中含有不可見(jiàn)的紫外線(xiàn)，紫外線(xiàn)是一種位于X射線(xiàn)和可見(jiàn)光波之間的電磁波，其波長(zhǎng)在200～400 nm又稱(chēng)紫外輻射[8]。

1.3.3紫外線(xiàn)的作用機(jī)理

紫外線(xiàn)是波長(zhǎng)136～390 nm的短于紫外波長(zhǎng)的射線(xiàn)，它是一種非電離輻射，能使被照射物質(zhì)的分子或原子中的內(nèi)層電子提高能級(jí)躍遷到能量高的外層軌道（稱(chēng)為激發(fā)），導(dǎo)致分子的理化變化[9]。

1.3.4 紫外線(xiàn)的使用方法

測(cè)定紫外光的劑量有直接法 （以爾格/平方毫米表示絕對(duì)劑量）和間接法（以輻照時(shí)間或致死率作為相對(duì)劑量）兩種。一般用15W的紫外燈，距離固定在30 cm左右，選用致死率達(dá)90%～99.9%所需的輻射時(shí)間進(jìn)行誘變處理。

輔射不宜在肉湯等成分復(fù)雜的液體中進(jìn)行，以免化學(xué)反應(yīng)的干擾；同時(shí)要有電磁攪拌設(shè)備，以求照射均勻，尤其在菌液濃度較大或菌體、孢子等較大而重時(shí)很容易在處理期間發(fā)生沉降，此時(shí)電磁攪拌更顯重要。照射前紫外燈宜先開(kāi)燈預(yù)熱20～30 min，使光波穩(wěn)定[10]。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 材料與設(shè)備

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）；生理鹽水，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂，氯化鈉，氫氧化鈉溶液；氯仿，液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[11]。

1 mL，5 mL移液管，燒杯，錐形瓶，酒精燈，磁力攪拌器，離心機(jī)，高壓滅菌鍋。

2.2 步驟

2.2.1 制備菌懸液

（1）取已培養(yǎng)48 h的活化枯草芽孢桿菌斜面4～5支，用無(wú)菌生理鹽水將菌苔洗下，并裝入盛有轉(zhuǎn)子的平皿中，放在磁力攪拌器上強(qiáng)烈振蕩，以打碎菌塊，使之?dāng)嚢杈鶆颉?/p>

（2）將菌液離心（3 000 r/min）15 min,棄上清液，將菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，最后制成菌懸液。

（3）用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為108mL-1。

2.2.2 配制培養(yǎng)基

（1）制作液體和固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

（2）將固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基熔化后，冷至45℃左右倒平板，凝固后待用。

2.2.3 配制無(wú)菌生理鹽水

將氯化鈉0.9 g蒸餾水1 000 mL溶解，進(jìn)行121℃，20 min高壓蒸汽滅菌，

2.2.4 紫外線(xiàn)處理

正式照射前開(kāi)啟紫外燈預(yù)熱約20 min。分別取制備好的菌懸液3 mL移入5個(gè)直徑為6 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在搖勻。15W紫外燈下30 cm處分別攪拌照射30，60，90，120，150 s。 不同誘變時(shí)間處理的菌懸液各取1 mL加入液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中37℃黑暗下培養(yǎng)24 h。同時(shí)取1 mL未經(jīng)誘變的菌懸液培養(yǎng)作為對(duì)照。

2.2.5 涂平板

培養(yǎng)24 h后，在紅光（酒精燈光）下，分別取上述經(jīng)誘變處理的菌懸液1 mL于裝于9 mL無(wú)菌水的試管中，搖勻；再?gòu)闹形? mL菌懸液，重復(fù)上個(gè)步驟，直至稀釋到10-4。用異步培養(yǎng)法[12]挑選高產(chǎn)單菌落。即將稀釋到10-5的菌懸液涂布平板，然后將其倒扣于裝有一薄層氯仿的培養(yǎng)皿蓋熏蒸50 min，讓菌落固定在固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面。移去培養(yǎng)皿蓋，讓平板中的氯仿?lián)]發(fā)40 min。 再取0.5 mL菌數(shù)為107～108mL-1的大腸桿菌菌懸液涂布在平板上。待平板晾干后培養(yǎng)72 h。

3 結(jié)果與討論

將培養(yǎng)72 h后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計(jì)算出致死率，即

表1 照射時(shí)間與致死率對(duì)比結(jié)果

由圖1和圖2可以看出，枯草芽孢桿菌在15W，30M處紫外誘變不同時(shí)間，30 s時(shí)致死率最低，但其正突變率太小。隨時(shí)間的增加，致死率越來(lái)越大，150 s時(shí)菌種幾乎全部被殺死。60,90,120 s 3個(gè)時(shí)間段的致死率相差不大，其中在誘變時(shí)間為120 s時(shí)效果最好。在此時(shí)誘變菌株的抑菌圈最大，正突變率（誘變后抑菌圈比誘變前抑菌圈增大的比例）最高外，致死率也是可以接受的范圍。

4 結(jié)束語(yǔ)

本文只做了在不同時(shí)間的紫外線(xiàn)照射下枯草芽孢桿菌的致死率和對(duì)大腸桿菌的抑菌作用的關(guān)系，還可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)了解不同時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響和不同接種量對(duì)抑菌效果的影響。

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Study of mutagenic effects of Bacillus subtilis using ultraviolet radiation

SUN Ai-jiea，SUN Ben-fengb，ZHAO Chun-jiea
（Heilongjiang Feihe Dairy Co.Ltd.,a.Key Laboratory；b.R&D Center（Beijing）,Qiqihar 161006,China）

Bacillus subtilis is a non-toxic and non-residual green feed additives.Research shows that Bacillus subtilis can be used for biological control or production of microbial fungicides to replace toxic chemicals.The use of UV-mutagenesis in Bacillus subtilis can achieve almost 100%death rate during experiment when treating 150 s.The mutagenic effect is the best when treating 120 s and the antibacterial effect against E.coli is most obvious.

Q936

A

1001-2230（2011）07-0012-03

2011-04-23

孫愛(ài)杰（1974-），女，助理工程師，從事乳品檢驗(yàn)方面的研究。