(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室,黑龍江佳木斯154007)

Livina特異性shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與克隆的鑒定

張春斌,饒冬梅,姜立松,劉 爽,張玉萍,江清林

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室,黑龍江佳木斯154007)

目的:構(gòu)建livina的shRNA表達(dá)載體,驗證livin靶向RNA干擾重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功并成功轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。方法:用DNA重組技術(shù)將人livina基因及它對應(yīng)的靶點(diǎn)shRNA克隆到表達(dá)載體pGenesil-1中,構(gòu)建livina的shRNA表達(dá)載體,然后通過酶切電泳、測序?qū)Λ@得的克隆進(jìn)行鑒定。結(jié)果:經(jīng)限制性酶切電泳及部分序列分析證明目的基因插入正確。結(jié)論:livina特異性shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建成功,可進(jìn)一步研究該shRNA對該細(xì)胞株內(nèi)源目的基因的干擾作用及對細(xì)胞的影響,為體外研究與livina相關(guān)的癌癥的治療探索新的生物途徑。

livina;shRNA;表達(dá)載體

Livin是抑制細(xì)胞凋亡蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IA P)家族的新成員。它含桿狀病毒 IA P重復(fù)序列(baculoviral IA Prepeats,BIR)和羧基端指環(huán)(RING)結(jié)構(gòu)域。其BIR功能區(qū)可與胱天蛋白酶(caspase)結(jié)合,抑制caspase的活性,尤其是caspase-3/-7和caspase-9的活性達(dá)到阻斷凋亡受體和以線粒體為基礎(chǔ)的凋亡途徑而起作用。其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物因剪切方式的不同產(chǎn)生兩種mRNA亞型,分別稱為livina及l(fā)ivinβ,livina和livinβ分別編碼298個氨基酸和280個氨基酸的蛋白質(zhì)。Gazzaniga P等[1]用半定量RTPCR技術(shù)檢測livina、livinβ的表達(dá),發(fā)現(xiàn)livina在正常膀胱組織中不表達(dá),而在一些具高復(fù)發(fā)率的實體瘤細(xì)胞中高表達(dá)。他們推測livin可能在淺表性膀胱癌中表達(dá),可用于早期診斷。研究表明livina在肺癌的發(fā)生,以及化療耐藥抗放射等過程中起重要作用,livina較livinβ對放射線的抵抗力更強(qiáng)[2]。正是因為livin在一些腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),與腫瘤的關(guān)系為人們所關(guān)注,成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn),目前以livin作為促凋亡治療靶點(diǎn)的研究也已經(jīng)開展。

RNAi(RNA interference)技術(shù)已經(jīng)成為在多種有機(jī)體中研究基因功能的一個必不可少的研究工具。RNA i技術(shù)以它高穩(wěn)定性、高效性、小分子性、高特異性、高穿透性的特點(diǎn),作為基因沉默的新技術(shù)備受關(guān)注?？茖W(xué)家很快認(rèn)識到了RNA i的治療潛力。目前國外有多家公司正在研發(fā)RNA i藥物,有的正處于臨床試驗階段。RNAi技術(shù)結(jié)合已有的高效基因傳遞系統(tǒng),使RNA i成為當(dāng)今高效特異而又簡便易行的基因治療工具[3]。

shRNA最接近生命自然狀態(tài)中的dsRNA,RNA干擾效果也最好。本文就是構(gòu)建livina的特異性shRNA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染入可表達(dá)目的基因的腫瘤細(xì)胞株后,可以特異性阻斷目的基因的表達(dá)。這對于今后研究特異的shRNA在該細(xì)胞株中對外源目的基因的表達(dá)及對細(xì)胞狀態(tài)的影響或在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步的研究該shRNA對該細(xì)胞株內(nèi)源目的基因的干擾作用,為體外研究與livina相關(guān)的癌癥的治療探索新的生物途徑。

1 材料

1.1 質(zhì)粒及菌株

質(zhì)粒pGenesil-1購自武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司,是以pEGFP-C1質(zhì)粒為骨架改造獲得的,可表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白,pGenesil-1的圖譜如圖1所示。大腸桿菌菌株DH5a由本教研室保存。

圖1 pGenesil-1的圖譜

1.2 主要試劑

LB培養(yǎng)基,LB瓊脂板培養(yǎng)基平板(自配)[4],Kanna(上海華舜生物),質(zhì)粒提取試劑盒(Sigma公司),瓊脂糖,TA E溶液,凝膠回收試劑盒(中鼎公司),質(zhì)粒小提試劑盒(中鼎公司),BIRC7 cDNA(武漢三鷹公司),T4 DNA Ligase、BamH I、H indIII、SalI、BglII、XhoI(N EB 公司)。

2 方法

2.1 Livin異構(gòu)體特異性shRNA的設(shè)計與合成

GenBank查詢獲得 livina(即BIRC7)基因cDNA 序列(GI:15680240),利用武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司的在線siRNA設(shè)計輔助工具尋找潛在的靶位點(diǎn),通過BLA ST分析去除和人類基因有同源性的序列,并通過RNA二級結(jié)構(gòu)分析篩選出2個合適的靶位點(diǎn),所設(shè)計的靶點(diǎn)為19nt的寡核苷酸序列:5’GTCTGGCCTCCTTCTA TGA 3’(417～435bp),5’TCCA TCGTCTTTGTGCCGT 3’(929～ 947bp),5’GACTTCA TAA GGCGCA TGC 3’(陰性對照序列)。根據(jù)三段序列及pGenesil-1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),設(shè)計并合成對應(yīng)于這三段寡核苷酸序列的cDNA模版序列,其結(jié)構(gòu)為:BamH I+Sense+Loop+A ntisense+終止信號+ SalI+H indIII,其實驗原理如圖2所示。

圖2 三段寡核苷酸序列的cDNA模版序列結(jié)構(gòu)

插入質(zhì)粒的三段cDNA模版序列為:(與上面的三個目標(biāo)序列對應(yīng))

以上序列由武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司合成。

2.2 shRNA表達(dá)載體pGenesil-1-shRNA的構(gòu)建(其構(gòu)建流程如圖3)與酶切

圖3 pGenesil-1-shRNA的構(gòu)建流程圖

2.2.1 單鏈目的基因片段的退火連接

各用50μLannealing buffer溶解上述合成2OD單鏈目的基 因片段,各取2μL(即2μLA+2μLB)+16μLannealing buffer混勻,94℃水浴退火自然冷卻至室溫,各取1退火產(chǎn)物+99μLH2O 做100倍稀釋。

2.2.2 線性化pGenesil-1

用BamH I+H indIII雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠回收大片段。

2.2.3 退火片段分別與線性化pGenesil-1質(zhì)粒表達(dá)載體的連接

稀釋退火片段1μL,線性化pGenesil-1質(zhì)粒載體1μL,10×Ligase Buffer 1μL,T4DNA Ligase 1μL,H2O 6μL,22℃水浴反應(yīng)過夜。

2.2.4 shRNA表達(dá)載體的擴(kuò)增與鑒定

各取5μL過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a,分別涂布于含Kanar抗性(終濃度為20μg/mL)的LB平板上,37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。從每個培養(yǎng)皿上各挑取3個單克隆菌落接種于3mL含Kanar抗性(終濃度為20μg/mL)的LB培養(yǎng)液中,37℃恒溫?fù)u床(250rpm)培養(yǎng)過夜。用小提試劑盒按說明書小量提取質(zhì)粒,并分別用SalI酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測陽性克隆。

2.3 融合表達(dá)載體pEGFP-BIRC7-shRNA的構(gòu)建(其構(gòu)建流程如圖4)與酶切

圖4 pEGFP-BIRC7-shRNA的構(gòu)建流程圖

2.3.1 目的基因BIRC7的擴(kuò)增

BIRC7上游引物:BglII 5’gaagatctA TGGGACCTAAA GACA GTGCCA 3’ BIRC7 下 游 引 物:XhoI5’ccgctcgagCTA GGACA GGAA GGTGCGCA 3’(小寫字母為保護(hù)堿基+ 酶切位點(diǎn))以BIRC7(c DNA)為模板,體外PCR擴(kuò)增基因BIRC7,1%瓊脂糖凝膠電泳回收BIRC7基因,在紫外燈光下切膠回收,用膠回收試劑盒,按說明書回收,用30μLH2O洗脫。

2.3.2 PCR反應(yīng)產(chǎn)物與pGenesil-1-shRNA的雙酶切

pGenesil-1-shRNA和PCR回收產(chǎn)物livin的BglII+XhoI雙酶切:DNA 6μL,10×H Buffer 2μL,BglII 1μL,XhoI 1μL,H2O 10μL。37℃水浴反應(yīng)過夜。

2.3.3 PCR反應(yīng)產(chǎn)物與pGenesil-1-shRNA的雙酶切片斷的連接

BIRC7基因片段4μL,質(zhì)粒pGenesil-1-shRNA 雙酶切大片段4μL,10×Ligase Buffer 1μL,T4 DNA Ligase 1μL,22℃水浴反應(yīng)過夜。

2.3.4 融合表達(dá)載體pEGFP-BIRC7-shRNA的擴(kuò)增與酶切

各取5μL過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5а,分別涂布于含Kanar抗性(終濃度為20μg/mL)的LB平板上,37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜,從每個培養(yǎng)皿上各挑取3個單克隆菌落接種于3mL含Kanar抗性(終濃度為20μg/mL)的LB培養(yǎng)液中,37℃恒溫?fù)u床(250rpm)培養(yǎng)過夜,用小提試劑盒小量提取質(zhì)粒(中鼎公司),并分別用BglII+XhoI做酶切。反應(yīng)條件如下:質(zhì)粒 DNA 6μL,10×H Buffer 2μL,BglII 1μL,XhoI 1μL,H2O 10μL,37℃水浴反應(yīng)3h。1% 瓊脂糖凝膠電泳,檢測陽性克謾。

2.4 質(zhì)粒pEGFP-BIRC7-shRNA的測序

送轉(zhuǎn)化菌液去測序。

3 結(jié)果

3.1 pGenesil-1的雙酶切

圖5中泳道1為質(zhì)粒pGenesil-1,泳道2為經(jīng)過雙酶切的線性化質(zhì)粒pGenesil-1。因結(jié)構(gòu)的不同線性化質(zhì)粒較酶切前質(zhì)粒電泳速度慢,因而應(yīng)跑在質(zhì)粒pGenesil-1的后面,如圖所示,質(zhì)粒pGenesil-1已經(jīng)線性化。

圖5 質(zhì)粒pGenesil-1的雙酶切圖

3.2 pGenesil-1-shRNA的酶切

質(zhì)粒pGenesil-1的多克隆位點(diǎn)(MCS)具有Sal1酶切位點(diǎn),在目的基因cDNA模版結(jié)構(gòu)中也設(shè)計有Sal1酶切位點(diǎn),兩位點(diǎn)間的最小距離約為400bp。圖6所示泳道2、4、6為酶切前的 pGenesil-1-shRNA,泳道3、5、7為經(jīng) Sal1酶切的pGenesil-1-shRNA,經(jīng)Sal1酶切的質(zhì)粒應(yīng)跑出約400bp的小帶,圖6所示,pGenesil-1-shRNA構(gòu)建成功。

圖6 Sal1酶切電泳圖

3.3 pEGFP-BIRC7-shRNA的雙酶切

插入的目的基因為該基因的CDS區(qū),共897bp,由pEGFP-BIRC7-shRNA的構(gòu)建流程圖可知,經(jīng)BglII+XhoI雙酶切的pEGFP-BIRC7-shRNA可切出一條長為897bp的小帶。由圖7所示泳道3、5、7跑出了約900bp的小帶,因此說明pEGFP-BIRC7-shRNA構(gòu)建成功。

圖7 BglII+XhoI雙酶切電泳圖

3.4 質(zhì)粒pEGFP-BIRC7-shRNA的測序

測序圖如圖8(包括8-1,2,3,4)所示。在原質(zhì)粒pEGFP基礎(chǔ)上先插入了干擾序列,然后在EGFP上連接了目的基因的CDS區(qū),使之融合表達(dá)。圖8-1為三個質(zhì)粒共有部分的測序圖,目的是對目的基因的CDS區(qū)進(jìn)行測序,由圖可知目的基因的CDS區(qū)成功插入了質(zhì)粒。圖8-2,3,4對三個質(zhì)粒的不同的部位進(jìn)行測序,由圖可知兩段干擾序列及陰性對照序列也插入成功。

8-1 pEGFP-BIRC7的測序圖

4 討論

Andrew Z.Fire和Craig C.Mello由于在RNA干擾(RNA interference,RNA i)及基因沉默現(xiàn)象研究領(lǐng)域的杰出貢獻(xiàn)而成為諾貝爾醫(yī)學(xué)獎獲得者。RNA i是近年來發(fā)現(xiàn)的研究生物體基因表達(dá)、調(diào)控與功能的一項嶄新技術(shù),它利用了由小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)引起的生物細(xì)胞內(nèi)同源基因的特異性沉默(silencing)現(xiàn)象,其本質(zhì)是siRNA與對應(yīng)的mRNA特異結(jié)合、降解,從而阻止mRNA的翻譯。RNA i是生物進(jìn)化的結(jié)果,是生物體對病毒基因等外源核酸侵入的一種保護(hù)性反應(yīng)。它普遍存在于各種生物,具有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子及監(jiān)控異常表達(dá)mRNA的生物學(xué)功能。RNA干擾現(xiàn)象不僅能提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段,而且有可能在基因功能測定,基因治療等方面開辟一條新思路。shRNA最接近生命自然狀態(tài)中的dsRNA,RNA干擾效果也最好。shRNA包含兩個有一個小環(huán)序列所分離的短反向重復(fù)序列,是由PolIII啟動子控制的,其中一個反向重復(fù)序列與目的基因互補(bǔ),shRNA隨后被加工成siRNA,降解目的基因的mRNA,抑制目的基因的表達(dá)。

livin的表達(dá)產(chǎn)物的功能被高度概括為:①對細(xì)胞凋亡的抑制作用;②有正負(fù)兩種生物功能的調(diào)節(jié),以livin為靶點(diǎn)的抗腫瘤策略的研究已取得了初步進(jìn)展。livin因子的研究對于探討腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)防都有重要意義[3]。

本文以livina為靶基因,根據(jù)siRNA設(shè)計原則[5],并通過RNA二級結(jié)構(gòu)分析,設(shè)計了2條針對目的基因的shRNA序列,一條陰性對照序列,并成功克隆至pGenesil-1中,構(gòu)建了pGenesil-1-shRNA載體,在此基礎(chǔ)上又構(gòu)建了融合表達(dá)載體pEGFP-BIRC7-shRNA,該載體所攜帶的序列位于基因的CDS區(qū),轉(zhuǎn)染進(jìn)入可表達(dá)目的基因的腫瘤細(xì)胞株后,可以特異性阻斷目的基因的表達(dá)。對于研究特異的shRNA在該細(xì)胞株中對外源目的基因的表達(dá)的影響,及對細(xì)胞狀態(tài)的影響。在此基礎(chǔ)上可進(jìn)一步的研究該shRNA對該細(xì)胞株內(nèi)源目的基因的干擾作用,及對細(xì)胞的影響。這為體外研究與livina相關(guān)的癌癥的治療探索出了一條新的生物途徑。

[1]Gazzaniga P,Gradilone A,GiulianiL.Expression and prognostic significance of Livin,Survivin and other apoptosis-related genes in the progression of superficial bladder cancer[J].Ann Oncol,2003,14(1):85-90

[2]Sun JG,Liao RX,Chen ZT,et al.Gene transfection of Livin isoforms into A549 cellline and its effect on cell growth and sensitivity to chemotherapy and radiotherapy[J].Journalof China tuberculosis and breath,2005,28(12):836-840

[2]孫建國,廖榮霞,陳正堂,等.Livin異構(gòu)體基因轉(zhuǎn)染對肺腺癌A549細(xì)胞生長及放化療敏感性影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2005,28(12):836-840

[3]Rao DM,Zhang CB,Zhang YP,et al.Advance of Livin-Antiapoptosis Factor[J].Int J Gent,2007,30(3):184-189

[3]饒冬梅,張春斌,張玉萍,等.凋亡抑制因子的研究現(xiàn)狀[J].國際遺傳學(xué)雜志,2007,30(3):184-189

[4]E Z.Organize culture and the molecule cytology technology[M].Beijing:Beijing Press,2001,291-293

[4]鄂征.組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)[M].北京:北京出版社,2001,291-293

[5]Elbashir SM,Harborth J,Weber K,et al.Analysis of gene function in somaticmammalian cells using small interfering RNA s[J].Methods,2002,26(2):199-213

Construction of livinaiso form-specific shRNA expression vector and clone identification

ZHANG Chun-bin,RAO Dong-mei,JIANG Li-song,LIU Shuang,ZHANG Yu-ping,JIANG Qing-lin
(College of Basic Medicine,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Objective:Toconstruct livinaspecific shRNA expression vectors and To verifywhether the livin-targeting RNA-interfering recombinant plasmids will be successfully constructed and transformed into E.colior not.Methods:Livinaspecificsh RNA expression vectors were constructed by inserting livinac DNA and shRNA to vectorp Genesil-1,and then electrophores with agrose gel after being digested by the restriction enzyme and sequence analysis.Results:Inserted gene was exactly attested by the restriction enzyme and partial sequence analysis.Conclusion:The recombinant vectors have been constructed successfully,which will help further studies of the shRNA interference onits cell line endogenous target gene and supply a biologicalways to treat cancer correlated with livina.

livina;shRNA;expression;vectors

Q 78

A

1008-0104(2011)06-0001-04

2011-09-13)

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目,編號:11511399;黑龍江省研究生創(chuàng)新科研資金項目,編號:YJSCX2005-113HLJ;黑龍江省衛(wèi)生廳資助項目,編號:2006-345。

張春斌(1972～)男,黑龍江伊春人,在讀博士,副教授,碩士研究生導(dǎo)師。

江清林(1964～)男,悔龍江林口人,碩士,研究員,碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:zcb19721972@yahoo.com.cn。