李 慧,安蓮效,郭 靜,顧月清

(中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210009)

人雌激素受體β綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

李 慧,安蓮效,郭 靜,顧月清

(中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210009)

目的 構(gòu)建人雌激素受體β(ERβ)綠色熒光蛋白 (GFP)真核表達(dá)載體,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌 MCF-7細(xì)胞。方法 通過雙酶切將 pCMV 5-hERβ中的人 ERβ cDNA克隆到 pEGFP-C3中,構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒 pEGFP-hERβ,然后轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞,采用 G418(500μg/mL)篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,在熒光顯微鏡下觀察融合蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分布,并采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)檢測 ERβ的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果 成功構(gòu)建重組表達(dá)載體 pEGFP-hERβ,有效轉(zhuǎn)染并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 ERβ基因的 MCF-7細(xì)胞系,外源性 ERβ基因在MCF-7細(xì)胞中獲得了有效轉(zhuǎn)錄,并在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均廣泛分布。結(jié)論 建立了穩(wěn)定表達(dá) ERβ的MCF-7細(xì)胞系,為篩選 ERβ調(diào)節(jié)劑和進(jìn)一步研究 ERβ在乳腺癌中的作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

雌激素受體β;載體構(gòu)建;轉(zhuǎn)染;MCF-7細(xì)胞

乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的 7%～10%。20世紀(jì)以來,乳腺癌的發(fā)病率在世界各地均有上升的趨勢,在歐洲、北美占女性惡性腫瘤發(fā)病的第 1～2位,因此積極研發(fā)用于乳腺癌治療的新靶點(diǎn)新方法具有重要的意義。雌激素是乳腺生長和發(fā)育所必需的,在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中亦具有重要作用,它主要通過與雌激素受體 (estrogen recep tor,ER)α和β結(jié)合來調(diào)控靶基因的表達(dá),產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。1996年,Kuiper等[1]首次由大鼠前列腺和卵巢 cDNA文庫中克隆得到了新的雌激素受體亞型 ERβ,它與 ERα一樣,屬于核受體超家族成員,是一類配體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子,通過與不同配體和反應(yīng)元件結(jié)合,調(diào)節(jié)一系列靶基因轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用。

已有大量文獻(xiàn)報(bào)道 ERβ在不同乳腺癌病人中的表達(dá)水平有所差異,提示 ERβ與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,可能是乳腺癌內(nèi)分泌治療有效的標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)之一,并可能成為新靶點(diǎn)用于開發(fā)雌激素相關(guān)疾病的防治藥物[2-3]。本研究通過構(gòu)建ERβ與綠色熒光蛋白 (green fluorescent p rotein,GFP)融合表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染人乳腺癌 MCF-7細(xì)胞并篩選出穩(wěn)定表達(dá) ERβ的細(xì)胞系,在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率及融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分布,并采用 RT-PCR方法檢測 ERβ的 mRNA水平,為進(jìn)一步研究 ERβ在配體調(diào)節(jié)下的定位與轉(zhuǎn)位,及在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和遷移中發(fā)揮的作用和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

UN IQ-10柱式 DNA膠回收試劑盒,上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;限制性內(nèi)切酶 Bam HⅠ、SacⅡ和 T4 DNA連接酶,大連寶生物工程有限公司;高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒,北京天根生化科技有限公司;梭華-Sofast基因轉(zhuǎn)染試劑,廈門太陽馬生物工程有限公司;G418、DNA marker Lambda DNA/HindⅢ PlusMarker-T、DNA Marker-B和 TRIzol試劑 ,Bio Basic Inc.公司;M-MLV Reverse Transcrip tase,Promega公司;Taq DNA Polymerase,上海捷瑞生物工程有限公司;人乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7和 pEGFP-C3質(zhì)粒,中國藥科大學(xué)奚濤教授惠贈(zèng);pCMV5-hERβ質(zhì)粒,意大利顧國偉博士惠贈(zèng)。

1.2 pEGFP-hERβ重組質(zhì)粒的構(gòu)建

分析 pCMV5-hERβ和 pEGFP-C3質(zhì)粒序列,采用 Bam HⅠ和 SacⅡ限制性酶雙酶切和連接反應(yīng)可將 ERβcDNA由 pCMV 5-hERβ質(zhì)粒亞克隆到 pEGFP-C3質(zhì)粒中,產(chǎn)生重組質(zhì)粒 pEGFP-hERβ,ERβ與GFP開放閱讀框正確一致。具體步驟為:將 pCMV5-hERβ和 pEGFP-C3分別經(jīng) Bam HⅠ和 SacⅡ分步雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳,然后采用UN IQ-10柱式DNA膠回收試劑盒分別回收純化1.5 kb的 ERβcDNA片段和 4.7 kb的 pEGFP-C3線性載體片段。取適量的上述兩種片段,以 T4 DNA連接酶連接后,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,從含卡那霉素的 LB轉(zhuǎn)化平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子,接種于含卡那霉素 (30μg/mL)的 LB液體培養(yǎng)基4 mL中,220 r/min、37℃培養(yǎng)過夜。用堿裂解法提取質(zhì)粒,得到的質(zhì)粒用 Bam HⅠ和 SacⅡ雙酶切鑒定以篩選陽性克隆,并測序得到重組質(zhì)粒 pEGFP-hERβ。

1.3 pEGFP-hERβ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞

將處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞用胰酶消化收集,計(jì)數(shù)并以 3.0×105/孔接種于 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加完全培養(yǎng)基 10%NBS(新生牛血清)-RPM I1640 2 mL,在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度 50%～60%。用梭華-Sofast基因轉(zhuǎn)染試劑按照優(yōu)化的條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染,具體步驟為:采用高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒提取 pEGFP-hERβ質(zhì)粒,取質(zhì)粒 2μg和梭華-Sofast 4.5μL分別稀釋于不含血清和抗生素的 RPM I 1640 100μL中混勻,將梭華-Sofast稀釋液 100μL滴加到質(zhì)粒稀釋液中,邊滴加邊混勻,室溫孵育 20 min后將梭華-Sofast/DNA復(fù)合物 200μL加到每孔中并輕輕搖勻,置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),設(shè) pEGFP-C3空質(zhì)粒對照。

1.4 ERβ穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系的建立

質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 MCF-7細(xì)胞 48 h后,轉(zhuǎn)染細(xì)胞按 1∶6傳代,更換含 G418終濃度 (500μg/mL)的 15%NBS-RPM I1640培養(yǎng)液進(jìn)行篩選,篩選 4周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系 MCF-7/ERβ及對照 MCF-7/GFP。由于 ERβ與報(bào)告基因增強(qiáng)型 GFP融合表達(dá),重組質(zhì)粒 pEGFP-hERβ轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后,通過藍(lán)光激發(fā)在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光可了解轉(zhuǎn)染效率、目的基因 ERβ在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)與定位。

1.5 RT-PCR檢測 ERβ基因的表達(dá)

分別消化收集 MCF-7、MCF-7/GFP和 MCF-7/ERβ細(xì)胞,計(jì)數(shù)并以 5.0×105/孔接種于 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加完全培養(yǎng)基 10%NBS-RPM I 1640 2 mL,置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。按照TRIzol試劑說明書提取總 RNA,以 oligo(dT)16為引物用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,PCR擴(kuò)增目的基因 ERβ,引物序列為:上游 5′-TAGTGGTCCATCGCCAGTTAT-3′, 下 游 5′-GGGAGCCACACTTCACCAT-3′,目的片段長度為 393 bp。同時(shí)擴(kuò)增βactin為內(nèi)參,引物序列為:上游 5′-CTGTGGCATCCACGAAACTA-3′, 下 游 5′-CGCTCAGGAGGAGCAATG-3′,目的片段長度為 192 bp。PCR擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性 5 min;94℃變性 30 s、58℃退火30 s、72℃延伸 30 s,共 35個(gè)循環(huán);72℃終末延伸7 min。PCR產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié) 果

2.1 pEGFP-hERβ重組質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng) Bam HⅠ和 SacⅡ雙酶切后,1%瓊脂糖電泳結(jié)果顯示,在約 1.5 kb和 4.7 kb處可見到明顯的 ERβ目的條帶和載體片段條帶,證明 ERβ基因已經(jīng)成功插入到 pEGFP-C3載體的多克隆位點(diǎn)中,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒 pEGFP-hERβ(圖 1)。測序結(jié)果顯示 ERβ基因 cDNA序列與 GenBank中的序列 (登錄號:NM_001437.2)完全相同,且插入位置及開放閱讀框正確。

圖1 重組質(zhì)粒 pEGFP-hERβ雙酶切鑒定Fig.1 Identification of the recombination plasmid pEGFP-hERβby double digestion

2.2 在熒光顯微境下觀察細(xì)胞的熒光

轉(zhuǎn)染 48 h后,熒光顯微鏡下可觀察到,轉(zhuǎn)染pEGFP-C3和 pEGFP-hERβ的細(xì)胞中 30%～40%有明顯綠色熒光,說明外源基因能夠有效轉(zhuǎn)入MCF-7細(xì)胞 (圖 2)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng) G418持續(xù)篩選 2周后,陽性細(xì)胞形成了明顯的陽性克隆,而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則完全死亡,繼續(xù)篩選并擴(kuò)增陽性細(xì)胞,得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系 MCF-7/ERβ。熒光顯微鏡下可觀察到,MCF-7/ERβ細(xì)胞中 ERβ-GFP融合蛋白的綠色熒光在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均廣泛分布 (圖 3)。

圖2 轉(zhuǎn)染 48 h后細(xì)胞的熒光情況 (×100)Fig.2 Fluorescence of transfected cells after 48 h(Original magnification×100)

圖3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 ERβ的MCF-7細(xì)胞 (×200)Fig.3 Stably ERβ-transfected MCF-7 cells(Original magnification×200)

2.3 MCF-7/ERβ細(xì)胞中 ERβ基因 mRNA表達(dá)水平

RT-PCR結(jié)果顯示 (圖 4),MCF-7、MCF-7/GFP和MCF-7/ERβ這 3組細(xì)胞均在約 200 bp處出現(xiàn)內(nèi)參β-actin基因的目的條帶。MCF-7/ERβ細(xì)胞在約400 bp處可見明顯 ERβ基因的目的條帶,而對照組的 ERβ基因目的條帶較弱,說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pEGFP-hERβ的MCF-7細(xì)胞中外源 ERβ基因可以獲得很好的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖4 RT-PCR法檢測MCF-7細(xì)胞中 ERβ的 mRNA表達(dá)水平Fig.4 Expression of ERβ in MCF-7 cells detected by RT-PCR

3 討 論

ERβ的發(fā)現(xiàn)拓展了我們對細(xì)胞內(nèi)雌激素信號途徑及雌激素對靶組織調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識。雌激素在乳腺、腦、泌尿生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)及骨骼系統(tǒng)等多種組織的正常生理和病理過程中均發(fā)揮著重要作用,并且在不同靶器官中的生理作用明顯不同甚至相反,ERα和 ERβ在組織的表達(dá)分布及其介導(dǎo)的信號途徑不同可能是產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因之一。ERβ基因定位于染色體 14q22-24,全長 ERβ由530個(gè)氨基酸殘基組成,與 ERα在結(jié)構(gòu)上具有較高的同源性,但它們的編碼基因、組織分布及在各組織中的表達(dá)量明顯不同,既有共同的也有特異的下游靶基因,與配體結(jié)合后產(chǎn)生的生物效應(yīng)以及基因敲除小鼠的表型亦不同[4]?？傊?ERα與 ERβ具有不同的生物學(xué)功能,且對于特異的配基、細(xì)胞類型、啟動(dòng)子環(huán)境具有不同的轉(zhuǎn)錄活性。

多數(shù)乳腺腫瘤表達(dá) ERα和 ERβ兩種受體,乳腺癌組織和細(xì)胞系中 ERβ的表達(dá)水平明顯低于正常乳腺上皮細(xì)胞,且在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中,ERα升高 ERβ下降,ERα/ERβ比值升高[5-6]。這提示 ERβ可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系,可能是乳腺癌內(nèi)分泌治療有效的標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)之一,并有可能成為抗雌激素藥物、雌激素替代藥物和雌激素受體拮抗劑等作用的靶標(biāo)。目前已有大量研究一致認(rèn)為,ERβ具有對抗乳腺癌發(fā)展的保護(hù)性作用,可能成為一個(gè)新的腫瘤抑制基因,其表達(dá)下調(diào)或缺失可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)重要因素[7-8]。

GFP是最先在水母中發(fā)現(xiàn)的一種生物發(fā)光蛋白質(zhì),其內(nèi)源熒光基團(tuán)在受到紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)(吸收峰主峰在 395 nm,另有一小吸收峰在 470 nm)可高效發(fā)射清晰可見的綠光,具有直觀、方便、及時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。EGFP是野生型 GFP的突變體,與GFP相比,它的熒光強(qiáng)度更強(qiáng),在真核細(xì)胞中表達(dá)量更高。因此,引入 EGFP報(bào)告分子,將有利于方便、快捷、實(shí)時(shí)的對轉(zhuǎn)染效率及 ERβ的表達(dá)、定位轉(zhuǎn)位及功能進(jìn)行監(jiān)測和研究。本研究通過構(gòu)建 ERβ-GFP真核表達(dá)載體 pEGFP-hERβ,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞,經(jīng) RT-PCR及熒光顯微鏡檢測,結(jié)果表明目的基因已整合到MCF-7細(xì)胞染色體基因組中并可長期穩(wěn)定表達(dá),ERβ-GFP融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均廣泛分布。這為進(jìn)一步研究配基調(diào)節(jié)的ERβ核轉(zhuǎn)位、篩選 ERβ調(diào)節(jié)劑及研究 ERβ在癌癥發(fā)生發(fā)展和治療中的作用和機(jī)制打下基礎(chǔ)。

[1] Kuiper G G,Enmark E,Pelto-Huikko M,et al.Cloning of a novel receptor expressed in ratp rostate and ovary[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(12):5925-5930.

[2] Speirs V.The evolving role of oestrogen receptorβ in clinical breast cancer[J].Breast Cancer Res,2008,10(5):111.

[3] Skliris G P,Leygue E,Watson P H,et al.Estrogen receptor alpha negative breast cancer patients:estrogen receptor beta as a therapeutic target[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2008,109(1-2):1-10.

[4] Zhao C,Dahlman-Wright K,Gustafsson JA.Estrogen receptor beta:an overview and update[J].Nucl Recept Signal,2008,6:e003.

[5] Bardin A,Boulle N,Lazennec G,et al.Loss of ERbeta expression as a common step in estrogen-dependent tumor progression[J].Endocr Relat Cancer,2004,11(3):537-551.

[6] Park B W,Kim K S,Heo M K,et al.Expression of estrogen receptor-beta in normal mammary and tumor tissues:is it protective in breast carcinogenesis?[J].Breast Cancer Res Treat,2003,80(1):79-85.

[7] Behrens D,Gill J H,Fichtner I,et al.Loss of tumourigenicity of stably ERβ-transfected MCF-7 breast cancer cells[J].Mol Cell Endocrinol,2007,274:19-29.

[8] Hartman J,Str?m A,Gustafsson J A.Estrogen recep tor beta in breast cancer-diagnostic and therapeutic implications[J].Steroids,2009,74(8):635-641.

Con struction of ERβgreen fluorescen t protein eukaryotic expression vector and its expression

LI Hui,AN Lian-xiao,GUO Jing,GU Yue-qing
(School of Life Science and Technology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

Purpose To construct a estrogen recep torβ(ERβ)green fluorescent protein eukaryotic expression vector and to transfect stably MCF-7 breast cancer cells.Methods The cDNA of human ERβ gene was cloned into pEGFP-C3 from pCMV5-hERβby double digestion to create recombinant plasmid pEGFP-hERβ.The recombinant plasmid was identified and transfected into MCF-7 cells.Then stable transfectants were selected by G418.The expression and localization of ERβin MCF-7 cells were assayed by fluorescence microscopy.The transcription of ERβin the stably transfected cells was also examined by RT-PCR.Results The ERβgreen fluorescent protein eukaryotic expressio vector was successfully constructed and effectively transfected into MCF-7 cells.Then the stably ERβ-transfected MCF-7 cell line was screened.The transcription of exogenous ERβ in transfected cells was confirmed,and the ERβwas abroad distributed in the cytop lasm and nucleus.Conclusion The stably ERβ-transfected MCF-7 cell line was established.It hasprovided an important basis for screening ERβmodulators and furtherly investigating the involvement of ERβin breast cancer as well as its mechanism.

estrogen receptorβ;vector construction;transfection;MCF-7 cells

Q78

A

1005-1678(2011)01-0018-04

2009-11-11

李 慧,女,碩士研究生;顧月清,通信作者,教授,博士生導(dǎo)師,Tel:025-83271046,E-mail:cpuyueqing@163.com。