于治國(guó)

（巢湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 巢湖 238000）

山茶花提取物預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

于治國(guó)

（巢湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 巢湖 238000）

目的：探討山茶花提取物（extract of Camellia japonica L,ECJ）預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：采用大腦中動(dòng)脈線栓法制作小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型，觀察ECJ預(yù)處理對(duì)小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注后腦梗死體積、血清小鼠神經(jīng)特異性烯醇化酶（NSE）的活性及丙二醛（MDA）含量的變化。結(jié)果：與模型組對(duì)比，ECJ（15mg.kg-1，30mg.kg-1，60mg.kg-1）預(yù)處理明顯減少腦梗塞體積，并可顯著降低血清中NSE和MDA含量。結(jié)論：山茶花提取物預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用。

山茶花提取物；腦缺血再灌注性損傷；藥物預(yù)處理；小鼠

腦缺血再灌注損傷是急性腦血管病發(fā)生與發(fā)展中重要的病理生理基礎(chǔ)。缺血預(yù)處理（Ischemic preconditioning，IP）最早是由Murry[1]等在犬心肌缺血模型中發(fā)現(xiàn)的，經(jīng)典缺血預(yù)處理的概念是指短暫的缺血再灌注能使心肌在隨后的長(zhǎng)時(shí)程缺血再灌注中得到保護(hù)，減少心梗面積和缺血再灌注損傷，。Kitagawa等證實(shí)該現(xiàn)象同樣存在于大腦，隨后更多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了缺血耐受的器官的普遍性[2]。藥物預(yù)處理（pharmacological preconditioning，PP）正是IP基礎(chǔ)上提出來(lái)的。山茶花提取物（ECJ）是一種黃酮類物質(zhì)，以往的研究發(fā)現(xiàn)ECJ對(duì)局灶性腦缺血再灌注性損傷具有良好的保護(hù)作用[3，4]。而山茶花提取物預(yù)處理（pharmacological precongtioning ofECJ）對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的影響機(jī)制未見(jiàn)明確的報(bào)道，因此，本研究就山茶花提取物預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制進(jìn)行了研究。

1.材料

1.1 藥品與試劑 ECJ：是用乙醇提取法提取山茶花中的有效成分，實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配成所需濃度；尼莫地平注射液（nimodipine,Nim）山東方明股份有限公司出品；TTC（氯化三苯四唑啉 2，3，5-triphenyl tetrazaliumchloride,TTC），丙二醛（MDA），小鼠神經(jīng)特異性烯醇化酶（NSE）測(cè)試盒均由南京建成生物研究所。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠，♀♂兼用，體重20-25g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)第02號(hào)。

2.方法

2.1 動(dòng)物分組：70只昆明種小鼠隨機(jī)分成7組，每組10只，♀♂各半。模型組（MODEL）：大腦中動(dòng)脈（MCA）線栓阻斷血流 60min，再灌注 24h；缺血預(yù)處理組（IP）：MCA線栓缺血5min后灌注5min，再缺血5min灌注30min，隨后缺血60min,再灌注 24h；ECJ 三個(gè)不同劑量組（15，30，60mg.kg-1）：持續(xù)5min靜脈推注不同劑量ECJ，停止給藥5min，再次持續(xù)靜脈給藥5min，30min后阻斷MCA血流60min,再灌注24h;尼莫地平組（2 mg.kg-1）：給藥及實(shí)驗(yàn)程序同ECJ組；假手術(shù)組：只手術(shù)但不阻斷MCA。

2.2 動(dòng)物模型制作：參照Longa[5]線栓法制作小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型。4%水合氯醛（100 mg·kg-1）腹腔注

射麻醉小鼠后，分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動(dòng)脈并結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在頸內(nèi)、頸外分叉處剪一小口，將頭端燒光滑的漁線插入至MCA起始部，進(jìn)線深度約為14mm±1mm。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取血清和腦，放入-20℃冰箱中冷凍保存，待測(cè)血清中NSE、MDA的含量。腦放入-20℃冰箱中速凍15min后制成2mm厚的冠狀切片，置于2%TTC磷酸緩沖液中37℃避光恒溫孵育30分鐘，10%甲醛固定，根據(jù)梗死腦組織不著色，正常腦組織著深紅色的原理，數(shù)碼相機(jī)拍照后利用圖象分析軟件測(cè)量腦梗死面積。缺血灶體積=∑（An.T），An為各腦片上的缺血灶面積，T為每片腦片的厚度；同樣的方法計(jì)算整個(gè)腦片的體積。計(jì)算缺血部分體積占全腦的體積的百分比[6]

3.統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.結(jié)果

4.1 ECJ預(yù)處理對(duì)小鼠腦梗死體積的影響

見(jiàn)表1,模型組小鼠腦梗死體積顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）。與 IP 組一樣，ECJ預(yù)處理在 30 mg·kg-1，60 mg·kg-1可降低MCAO致小鼠腦組織梗死體積百分比的升高。預(yù)處理Nim也有類似的結(jié)果。

4.2 ECJ預(yù)處理對(duì)小鼠血清中MDA、NSE影響

表1 ECJ預(yù)處理對(duì)腦缺血小鼠腦梗死體積的影響（x±s，n=8）

見(jiàn)表2,與假手術(shù)組比較，模型組血清中MDA及NSE含量均有顯著升高（P＜0.01）。IP和Nim預(yù)處理可顯著降低血清中 MDA及 NSE 的增高（P＜0.01），在 30 mg·kg-1，60mg·kg-1劑量，ECJ預(yù)處理亦可明顯降低血清中NSE和MDA含量的升高。

表2 ECJ預(yù)處理對(duì)小鼠血清中MDA及NSE含量的影響（x±s，n=8）

5.討論

眾多的研究表明一次或多次短暫缺血后,可提高腦組織對(duì)隨后較長(zhǎng)時(shí)間缺血及再灌注的耐受力,是機(jī)體的一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制[7,8,9]。缺血再灌注損傷與氧自由基的生成有密切關(guān)系。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的共同產(chǎn)物，細(xì)胞中MDA的量常可反應(yīng)機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映腦細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度和細(xì)胞損傷的程度，因此MDA是評(píng)價(jià)腦缺血再灌注損傷的較好指標(biāo)之一[9]。

烯醇化酶是糖糖酵解中酶-烯醇化酶的同工酶，普遍存在于生物體細(xì)胞漿中，共有5種同工酶。NSE是特異存在于腦神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的胞漿中，腦組織缺血、缺氧、壞死，神經(jīng)元細(xì)胞膜的完整性發(fā)生變化，NSE從細(xì)胞內(nèi)漏至血漿中，引起血漿內(nèi)濃度增高，故血清中NSE含量的改變可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷較特異和靈敏的指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠 MCAO后，腦梗死面積、血清中NSE活性以及自由基代謝產(chǎn)物MDA明顯增多，而ECJ預(yù)處理與IP類似可顯著降了腦梗死面積、血清中的NSE以及MDA的含量。

綜上所述，ECJ預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。

[1]Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioningwith ischemia：a delayof lethal cell injury in ischemic myocardium［J］．Circulation,1986,74（5）：1124-1132.

[2]Kitagawa K,Matsumoto M,Oda T,et al.Free radical generation during brief of cerebral ischemia trigger delayed neuronal death[J].Stroke,1990,35（3）：551-558.

[3]尹明華，洪森榮，邵興華.山茶花提取物對(duì)腦缺血再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的改善作用[J].中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2007,16（12）：1070-1071.

[4]羅勝勇，董六一，范麗，方明，陳志武.山茶花總黃酮對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，8（10）：1157-1159.

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R961 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

A

1671-752X（2011）04-0035-02

2011-08-22

于治國(guó)（1979-），男，安徽巢湖人，巢湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)分院助理實(shí)驗(yàn)師。

夏萬(wàn)夫）