門(mén)晶，接晶，高學(xué)軍，李慶章

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

靶向奶牛Lepr基因的miR-30d報(bào)告基因載體構(gòu)建及靶向驗(yàn)證

門(mén)晶，接晶，高學(xué)軍，李慶章

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

構(gòu)建靶向奶牛Lepr基因的miR-30d熒光素酶報(bào)告基因載體，驗(yàn)證奶牛乳腺中瘦素受體基因（Lepr）是否為miR-30d的生物學(xué)靶基因。將microRNA熒光素酶表達(dá)報(bào)告載體特異性改造，使其含有TargetScan預(yù)測(cè)的與miR-30d靶向結(jié)合的奶牛Lepr基因序列，對(duì)miR-30d與重組熒光素酶載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裂解液進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)分析。結(jié)果表明，靶向奶牛Lepr基因的miR-30d熒光素酶表達(dá)報(bào)告載體構(gòu)建成功，奶牛Lepr基因是miR-30d的靶基因，旨為miR-30d與Lepr基因的相互作用及與此基因相關(guān)的乳腺生物網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Lepr；miR-30d；報(bào)告基因

0 引言

MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的內(nèi)源性非編碼小RNA[1，2]，其通過(guò)對(duì)靶mRNA的切割或翻譯抑制來(lái)下調(diào)目的基因表達(dá)[3]。瘦素受體（LEPR）是一種跨膜受體，通過(guò)Lepr基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響著機(jī)體的多種生理過(guò)程[4，5]，并在哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)育、泌乳及退化過(guò)程中起著十分重要的作用[6-9]。本研究以荷斯坦奶牛乳腺Lepr這一泌乳相關(guān)重要功能調(diào)控基因與miR-30d靶向結(jié)合作用為切入點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建miRNA熒光素酶報(bào)告基因載體對(duì)TargetScan中預(yù)測(cè)的miR-30 d的擬靶基因Lepr進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為奶牛乳腺發(fā)育與泌乳調(diào)控提供必要的研究手段和奠定重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

Trizol、Lipofectamine2000（Invitrogen），ExTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶SpeⅠ、HindⅢ、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)及T4-DNA連接酶（TaKaRa），質(zhì)粒小量制備與純化試劑盒、PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒（Axgene），miR-30d表達(dá)質(zhì)粒（GenePharma），Dual-LuciferaseReporter Assay Systerm（Promega），含Amp抗性的LB液體和固體培養(yǎng)基，氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 載體與感受態(tài)細(xì)胞

pMDTM18-T載體、JM109感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa），pMIR-REPORT Luciferase miRNA Expression Reporter Vector（Ambion）。

1.1.3 組織材料與細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)室凍存的處于正常生理狀態(tài)的荷斯坦奶牛乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞（荷斯坦奶牛購(gòu)自黑龍江省畜牧業(yè)科技園區(qū)）。

1.2 方法

1.2.1 靶基因預(yù)測(cè)與引物設(shè)計(jì)

運(yùn)用生物信息學(xué)方法進(jìn)行預(yù)測(cè)，在TargetScan中，檢索牛（Bta）這一物種中Lepr是否為miR-30 d的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因。根據(jù)預(yù)測(cè)，針對(duì)Bta-miR-30 d中編碼Lepr基因mRNA的3’UTR中包含有上述靶向結(jié)合位點(diǎn)的185 bp目標(biāo)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并在引物中引入SpeⅠ和HindⅢ兩酶切位點(diǎn)及其各自酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基，引物由上海英俊公司負(fù)責(zé)合成。

1.2.2 總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄

取出液氮中預(yù)先凍存的荷斯坦奶牛乳腺組織，采用液氮研磨法并按照Invitrogen Trizol RNA提取說(shuō)明書(shū)中的操作步驟進(jìn)行總RNA的提取。選用所提取的總RNA完整度較好且質(zhì)量較高的樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物純化

以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板按照PCR反應(yīng)體系與條件進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析驗(yàn)證，目的帶與分子量標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)后按照膠回收試劑盒操作步驟將目的片段純化回收。

1.2.4 T載體的重組與測(cè)序

純化回收的PCR產(chǎn)物與pMDTM18-T載體連接，然后將其轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增。挑選陽(yáng)性克隆37℃過(guò)夜培養(yǎng)，得到的菌液按照質(zhì)粒提取試劑盒的操作步驟提取重組T載體質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒為模板用PCR與電泳結(jié)合的方法初步鑒定，目的帶與分子量標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)符合理論值185 bp后交TaKaRa公司測(cè)序。

1.2.5 基因載體的重組與測(cè)序

根據(jù)引物引入的酶切位點(diǎn)對(duì)連有目的片段的T載體用SpeⅠ和HindⅢ進(jìn)行37℃過(guò)夜雙酶切，純化回收與miR-30d靶向結(jié)合并帶有相應(yīng)粘性末端的目的DNA片段。利用SpeⅠ與HindⅢ將自身帶有這兩種酶切位點(diǎn)的pMIR-REPORT miRNA熒光素酶表達(dá)報(bào)告載體質(zhì)粒37℃過(guò)夜雙酶切，將開(kāi)環(huán)質(zhì)粒純化回收。T4-DNA連接酶連接目的DNA片段與開(kāi)環(huán)質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增。挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，按照質(zhì)粒提取試劑盒的操作提取重組載體質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)PCR與電泳結(jié)合的方法初步鑒定后交TaKaRa公司測(cè)序。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇本實(shí)驗(yàn)室凍存的荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)為15%的胎牛血清和1倍雙抗的DMEMF-12培養(yǎng)液于37℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)與傳代。

1.2.7 細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d選用1瓶約90%貼壁且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔細(xì)胞密度約為1×105個(gè)，每孔加入500 μL不含雙抗的15%胎牛血清的DMEMF-12培養(yǎng)液過(guò)夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)每孔細(xì)胞貼壁達(dá)80%以上，以靶向奶牛Lepr基因的miR-30 d重組質(zhì)粒載體作為對(duì)照，每孔都轉(zhuǎn)入10 ng質(zhì)粒載體pRL-TK作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)對(duì)照來(lái)校正各組之間的差異，具體實(shí)驗(yàn)分組如下（表1）所示。轉(zhuǎn)染時(shí)重組質(zhì)粒載體與miR-30d表達(dá)質(zhì)粒的加入量約為每孔100 ng和500 ng，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的加入量比為1∶3，具體操作根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于熒光素酶活性的檢測(cè)。

表1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組

1.2.8 熒光素酶活性檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h后按照Promega公司的雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒的操作進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。棄去待測(cè)細(xì)胞的培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞兩次，殘留液體吸出后加入被動(dòng)裂解液PLB裂解細(xì)胞15 min，收集獲得待測(cè)細(xì)胞裂解液。向測(cè)量管中加入20 μL細(xì)胞裂解液和100 μL的LARⅡ，測(cè)量得到熒光值1，再向測(cè)量管中加入100 μl的Stop&Glo試劑，測(cè)得熒光值2。值1比值2即得到相對(duì)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 基因載體構(gòu)建結(jié)果

TargetScan中，在牛（Bta）這一物種中Lepr是否為miR-30d的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因的具體預(yù)測(cè)結(jié)果及靶向結(jié)合位點(diǎn)如圖1所示。

根據(jù)奶牛Lepr的3’UTR與miR-30 d特異性結(jié)合的位點(diǎn)設(shè)計(jì)出185 bp目的片段的PCR引物，該引物帶有SpeⅠ和HindⅢ兩酶切位點(diǎn)及其各自保護(hù)堿基，序列如下：

凍存的奶牛乳腺組織中提取的RNA完整性較好、質(zhì)量較高，可以用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA模板（圖2）。利用已獲得的cDNA模板與引物通過(guò)PCR得到大小為185 bp的目的片段（圖3），純化回收后與pMDTM18-T載體連接，感受態(tài)擴(kuò)增后純化回收，PCR法驗(yàn)證回收產(chǎn)物（圖4）。初步驗(yàn)證符合理論值185 bp后，將重組T載體質(zhì)粒送出測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確（圖5），證明實(shí)驗(yàn)已獲得含miR-30d靶向結(jié)合位點(diǎn)的奶牛Lepr的3’UTR序列的T載體重組質(zhì)粒。

圖3中，1為DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2和3為185bp的目的片段。

圖4中，1為DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為185bp的目的片段和重組T載體質(zhì)粒。

將回收得到的帶有相同粘端的185 bp目的片段和開(kāi)環(huán)miRNA熒光素酶表達(dá)報(bào)告載體質(zhì)粒連接，重組熒光素酶表達(dá)報(bào)告載體質(zhì)粒經(jīng)感受態(tài)擴(kuò)增且純化回收后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確（圖6），證明靶向奶牛Lepr基因的miR-30d熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建成功。

圖6 重組熒光素酶表達(dá)報(bào)告載體質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

2.2 熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室凍存的荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)，獲得了可供轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞（圖7）。

圖7 奶牛乳腺上皮細(xì)胞（200×）

用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的裂解液熒光素酶的活性，利用SPSS 13.0 Duncan法對(duì)活性值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。與重組質(zhì)粒載體對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-30 d熒光表達(dá)質(zhì)粒組使熒光素酶報(bào)告重組子的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）（圖8），可以說(shuō)明TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果正確，奶牛Lepr是miR-30d的靶基因。

圖8 相對(duì)熒光素酶活性檢測(cè)

圖8中，A組為熒光素酶重組質(zhì)粒載體，B組為熒光素酶重組質(zhì)粒載體+miR-30d，C組為熒光素酶重組質(zhì)粒載體+miR-139，同列字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

miRNA廣泛存在于動(dòng)物、植物、一些病毒甚至藻類(lèi)中，是小分子非編碼RNA家族的重要成員之一。miRNA通過(guò)對(duì)靶mRNA切割或翻譯的抑制來(lái)下調(diào)目的基因的表達(dá)，諸多研究表明miRNA在生長(zhǎng)發(fā)育、增殖分化、病毒感染和腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)事件中扮演重要角色，準(zhǔn)確地對(duì)靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)是研究miRNA作用機(jī)制和其生物學(xué)功能的必備前提[10]。第一個(gè)miRNA及其靶基因是1993年通過(guò)分離和克隆細(xì)胞內(nèi)小分子RNA的方法鑒定的，但此方法靈敏度很低。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，miRNA靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)在miRNA靶基因的預(yù)測(cè)中起到了積極的作用，許多種靶基因預(yù)測(cè)軟件應(yīng)運(yùn)而生。本研究選取奶牛乳腺發(fā)育和泌乳相關(guān)重要功能調(diào)控基因Lepr為靶標(biāo)基因，根據(jù)miRNA靶基因預(yù)測(cè)常用軟件TargetScan對(duì)在牛這一物種中與Lepr靶向互補(bǔ)結(jié)合的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明miR-30 d與Lepr的匹配位點(diǎn)單一且匹配度較高，故以miR-30 d與Lepr的靶向相互作用為切入點(diǎn)展開(kāi)研究。

報(bào)告基因是指表達(dá)產(chǎn)物易被檢測(cè)且能夠與內(nèi)源性蛋白相區(qū)別的基因。報(bào)告基因應(yīng)用廣泛、種類(lèi)繁多。隨著報(bào)告基因技術(shù)的發(fā)展，熒光素酶、綠色熒光蛋白等在檢測(cè)組織和細(xì)胞基因表達(dá)、研究疾病發(fā)生機(jī)理及基因靶向治療的分子機(jī)制等方面發(fā)揮了重要作用。常見(jiàn)的報(bào)告基因有β-半乳糖苷酶、熒光素酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、分泌性堿性磷酸酶等[11]，但熒光素酶報(bào)告基因載體系統(tǒng)是目前miRNA靶基因驗(yàn)證的常用方法，該方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

本研究通過(guò)對(duì)奶牛乳腺總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄，將miR-30 d與其預(yù)測(cè)靶基因奶牛Lepr基因3’UTR結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的185 bp序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并PCR擴(kuò)增。驗(yàn)證并純化擴(kuò)增產(chǎn)物后將其插入熒光素酶編碼區(qū)下游，成功構(gòu)了建熒光素酶報(bào)告基因載體。將構(gòu)建好的報(bào)告基因載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及與miR-30 d共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后進(jìn)行熒光活性變化檢測(cè)，并對(duì)熒光活性數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明：熒光素酶載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與熒光素酶載體質(zhì)粒和miR-30 d共轉(zhuǎn)染組相比，熒光活性值顯著降低（P＜0.05），證明了Lepr是miR-30 d的靶基因，為進(jìn)一步研究miR-30 d對(duì)Lepr基因表達(dá)及相關(guān)生物網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)錄后的水平調(diào)控提供了實(shí)驗(yàn)分析手段。

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Construction of dairy cow Lepr targeting miR-30d reporter gene vector and verification of its targeting

MEN Jing,JIE Jing,GAO Xue-jun,LI Qing-zhang
(The Key Dairy Science Laboratory of Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

To establish luciferase reporter vector of dairy cowLeprtargeting miR-30d,and identify ifLepris a target gene of miR-30d in dairy cow mammary gland.The luciferase expression reporter vector was rebuilt with the sequence whichLeprcould combine with miR-30d.The cells which miR-30d and the rebuilt vector were cotransfected in were fragmentated and the luciferase activity was detected.The luciferase expression reporter vector is constructured successfully,Lepris a target gene of miR-30d.This study establishes the experimental foundation for both the interaction between miR-30d andLeprand the regulation of miR-30d on the biological network associated withLepr.

Lepr;miR-30d;reporter gene

Q936

A

1001-2230（2011）05-0004-03

2011-01-10

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展（973）計(jì)劃（2011CB100804），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(CXT005-1-1/CXT005-1-2)。

門(mén)晶（1983-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槊谌樯飳W(xué)與乳腺生物調(diào)控。

李慶章